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ありがとうございます 削除/引用 No.384-8 - 2011/05/12 (木) 15:45:53 - D ありがとうございます。いろいろ勉強になります。 沢山コメントいただき、お答えした方がいいこともあるようですが、 とりあえずポレーション用のコンピを準備中です。 また１８度（可能な限り近づける）での培養のための機器の確保をして、 やってみたいと思います。 この辺りをやってみて、改善が見られなければ、また書かせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.384-7 - 2011/05/12 (木) 10:13:15 - Boston-Pullman 前のラボではご自身でちゃんと作られていたのでしょうか？学生任せのラボもあるので。正確には下っ端時代に身につける事なので。 皆さんがご指摘の様に低温培養が基本中の基本です。培養を終えて、すぐに遠心するのでは無く、氷水中でフラスコがキンキンに冷えて白っぽくなるまでひたすら攪拌して急冷します。腕がパンパンになります。それで１０の８乗くらいです。 ケミカルコンピにこだわるのであれば、前のラボのヒトに教わるのがベストです。

(無題) 削除/引用 No.384-6 - 2011/05/12 (木) 09:14:57 - ~ まず始めに、必要なタイターはいくつですか？ それが決まらないと、今のコンピを使えるのか、改良が必要なのかが決まりません。 >今クローニングしているものは、平滑末端のライゲーション産物で効率が悪いのと、もともとコピー数の低いベクターを改変してので クローニングなのでしょうか？それともサブクローニングなのでしょうか？ サブクローニングであれば、10^6は十分すぎるタイターだと思いますが。 平滑だからといって、2桁落ちても取れますよね。 ベクターのサイズが大きいというのでなく、単にコピー数が低いoriであれば、コピー数と導入効率の相関はそれほど高くないのではないでしょうか。 株によって得られるタイターが低くなる場合がありました。 気相での培養であれば、インキュベーターにチラーが無くても、 少なくとも室温までは下げれますよね。 すこしはましになるかもしれません。 エレクトロコンピは1日半で作れますよね。 機材があるのでしたら、明日エレクトロポレーションをして、月曜日にはタイターが分かるのでは。 試薬グレードのグリセロールでも、10^8はいっていました。

(無題) 削除/引用 No.384-5 - 2011/05/11 (水) 22:12:33 - AP >エレクトロポレーションに切り替えようかとも思っていますが もしすでに装置があるのなら、エレクトロポレーションを使わずケミカルコンピーテントセルに固執するメリットはあまりないと思います（あったとしてもエレクトロポレーションのメリットの方が大きい）。

(無題) 削除/引用 No.384-3 - 2011/05/11 (水) 21:12:03 - AP 井上・野島の方法は、低温培養するのが味噌ですぞ。バッファーだけそれに準じても意味なし。

(無題) 削除/引用 No.384-2 - 2011/05/11 (水) 21:08:50 - 中年 以前より効率が落ちた原因は私には分かりませんが、効率に関しては原法どおりに低温培養することで大幅に改善できると思います。なぜ37℃で培養されているのでしょうか？

コンピテンシーが上がらない 削除/引用 No.384-1 - 2011/05/11 (水) 18:04:24 - D 現在、大腸菌(One Shot® ccdB Survival™ T1 Phage Resistant Cells)の自作ケミカルコンピを作っていますが、コンピテンシーが上がらなくって悩んでいます。 Inoue transformetion bufferを使った方法で、37度で培養している点と、スケールダウンして100ml培養にしている以外はMolecular cloningの方法に準拠しています。 以前（のラボで）はこの方法でDH5aやJM109のコンピが10^8-9で作れていました。そして、今回がラボを移ってから初めてで、2回試しましたがコンピテンシーがどうしても10^6オーダーになってしまいます。 新しいラボでは、そもそもそれほど高いコンピテンシーのものは作っていない様で、情報が不足しています。 場所が変わったので機器、試薬等の問題も考えています。 大きな変更点としては培養がウオーターバスの往復浸透型から気相インキュベーターの回転式に変わったのと、 遠心条件がアングルローターから水平ローターに変わりました。 このあたりに問題が考えられるでしょうか？ また、並行して作ったDH5aのコンピテンシーが10^7オーダーであるので、菌の性質の問題の様な気もしています。確か同じccdb耐性のDB3.1株のコンピテンシーは低くなる傾向にあると聞いたことがあります。 現在使用している、菌株に対する情報をお持ちのかたがいたら教えてください。 今クローニングしているものは、平滑末端のライゲーション産物で効率が悪いのと、もともとコピー数の低いベクターを改変してので、高性能のコンピテントセルが必要だと考えています。 エレクトロポレーションに切り替えようかとも思っていますが、その辺りもご意見いただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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