BioTechnicalフォーラム [トランスファーがきれいにできません]

(無題)

No.383-26 - 2011/05/16 (月) 13:52:52 - KT

> あらたにフィルター購入することで、解決しました。

幸いにもフィルターは購入後2ヶ月以内。メンブレンは一ヶ月以内のものです。

> 地方の古いラボで、昔の遺産は未使用のままでいっぱいある。

年度末調整で適当に購入した大量の試薬やゲルやその他もろもろが、開封されることなく使用期限を迎える悲しい現実が結構あります。
税金の無駄遣いこの上ないですよね・・・・。

フィルターは、購入後どれぐらいたってますか？

削除/引用

No.383-25 - 2011/05/16 (月) 13:01:35 - ひろたｎ

１０年ぐらい前のニトロセルロースを使ったら、あなたとおなじような
抜けになやまされました。
あらたにフィルター購入することで、解決しました。

こんなの簡単という思い込みがいけなかったと反省しています。

地方の古いラボで、昔の遺産は未使用のままでいっぱいある。
数回チェックしたいためだけなのでフィルター購入するのも・・・。
ウエスタンブロットは、昔つとめていたラボさんざんでやっていたから、
技術は大丈夫。
プレステインマーカーもうまくいっているし・・・。
（マーカーは端っこだからだまされる）
等々

(無題)

削除/引用

No.383-24 - 2011/05/15 (日) 23:06:17 - ＫＴ

> ただ売られていて使っている人もいるのでちょっとしたことで解決しそうな気もしますが、あなたの研究室でほかの人はどうなんでしょうか。

うーん。私の研究室ではそこまでウエスタンにこだわっている人はいないんですよね。だから初心者の私が手探り状態なんです・・・

> ただ直列やってみましたけど上下で移り方が違ったのでそれからはやっていません。うまくいったなら一度話を聞かせてほしいものです。

うつり方が違っても、均等にトランスファーされてたら御の字なのですが・・・。不均一なのが一番ショックですね。
ポンソーのおかげで失敗が早期にわかるので抗体の無駄はありませんが・・・。

一度自分で試してみます。

(無題)

削除/引用

No.383-23 - 2011/05/15 (日) 14:55:24 - おお

>[Re:22] ＫＴさんは書きました :
>
> > 厚い濾紙だと濾紙がしっかりバッファーでぼうじゅんしてないせいかと勝手に勘ぐってます。
>
> だとすると、厚いろ紙の場合は長めに浸しておけば大丈夫ですかね？

そういう理屈になりますが、長めといっても何がクリアーになったらOKなのか見えるものでもないですし勘ぐりを入れている段階でうすいフィルターペーパーに変えてしまいました。なので解決方法としてそれで万全なのかわかりません。ただ売られていて使っている人もいるのでちょっとしたことで解決しそうな気もしますが、あなたの研究室でほかの人はどうなんでしょうか。
直ぐにいる実験ならとりあえず薄いものでやって、条件検討を厚いのでやるのも方法かと思います。うまく行かないのはストレスフルですし、ほかの試薬の無駄(抗体とか)もあるでしょうから。

>
> >2枚並列してセットするとトランスファーにむらができてしまい同様のことが起こったりします。
>
> bio-radのサイトで器械の使い方を読むと、２枚転写するばあいはまず直列セットする方を先に説明していますね。並列はあまりお勧めでないのかも。

ありがとうございました。そこはよんでませんでした。ただ直列やってみましたけど上下で移り方が違ったのでそれからはやっていません。うまくいったなら一度話を聞かせてほしいものです。

並列・・・・

削除/引用

No.383-22 - 2011/05/15 (日) 07:00:31 - ＫＴ

> 厚い濾紙だと濾紙がしっかりバッファーでぼうじゅんしてないせいかと勝手に勘ぐってます。

だとすると、厚いろ紙の場合は長めに浸しておけば大丈夫ですかね？というのも厚手のろ紙が大量にストックしてあるため、新しいのに換えるのも気が引けるので・・・・。

>2枚並列してセットするとトランスファーにむらができてしまい同様のことが起こったりします。

bio-radのサイトで器械の使い方を読むと、２枚転写するばあいはまず直列セットする方を先に説明していますね。並列はあまりお勧めでないのかも。
でもろ紙→膜→ゲル→ろ紙→ろ紙→膜→ゲル→ろ紙と厚く重ねたらそれこそ脱水やムラの原因になったりしないか不安です。捨て実験として試してみようと思います。

> 気泡が入る場合は気泡のある部分が完全に抜け材木の節をくり抜いたような感じで、また輪郭がはっきりした領域が見れると思います、バッファーや圧力が不均一であるなら、ある部分は薄くなったり、その部分を避けるようにトランスファーが歪んだりするのではという印象があります。

おっしゃる通りだと思います。

かなり改善・試用するべき点がみえてきました。

みなさん、同じようにお悩みになった経験があるのがわかって非常に安心しました。

(無題)

削除/引用

No.383-21 - 2011/05/15 (日) 05:38:45 - おお

私の場合、分厚い濾紙を使うと同様のことが起こったりしましたので、3MMフィルターベーパーを３枚ぐらいつかってます。厚い濾紙だと濾紙がしっかりバッファーでぼうじゅんしてないせいかと勝手に勘ぐってます。また、どういうわけか2枚並列してセットするとトランスファーにむらができてしまい同様のことが起こったりします。均一に圧力がかけられないのかなぁと思ったりします。
気泡が入る場合は気泡のある部分が完全に抜け材木の節をくり抜いたような感じで、また輪郭がはっきりした領域が見れると思います、バッファーや圧力が不均一であるなら、ある部分は薄くなったり、その部分を避けるようにトランスファーが歪んだりするのではという印象があります。

(無題)

削除/引用

No.383-20 - 2011/05/14 (土) 22:24:15 - ＫＴ

> わたしはほとんどの場合、SDSを入れています。
> トピ主さんの気泡は電気をいれてからの問題です。
> ろ紙や膜がゲルより大きいと、隙間で生じた泡が入り込んできます。
> そのため、ゲルと同じ大きさのろ紙と膜を使うようにアドバイスしました。

なるほど。ＳＤＳが問題ではなく、きちんとした手間が必要ということですね。

> 電気を効率よくゲルから膜へと通したいのであれば、最小限のバッファーを使うべきです。ムラも減ると思います。不安ならば、ろ紙の枚数を増やせばいいだけなので。

おっしゃる通りですね。焦げ付きが心配ならろ紙をふやせばいいのですよね。

> PBSTは試薬ビンにいれていたので、そのままふたを固定する感じで、中央に置いていました。

御指示通りやってみます。

ありがとうございます。

(無題)

削除/引用

No.383-19 - 2011/05/12 (木) 01:10:51 - Boston-Pullman

わたしはほとんどの場合、SDSを入れています。

トピ主さんの気泡は電気をいれてからの問題です。
ろ紙や膜がゲルより大きいと、隙間で生じた泡が入り込んできます。
そのため、ゲルと同じ大きさのろ紙と膜を使うようにアドバイスしました。

個人の好みの問題かも知れませんが、セミドライをバッファーでひたひたにするのは好きではありません。電気を効率よくゲルから膜へと通したいのであれば、最小限のバッファーを使うべきです。ムラも減ると思います。私の場合は、全部セットして、一番下のろ紙の周りに５ｍｍ程度バッファーが広がっている程度です。４０分は十分持ちます。不安ならば、ろ紙の枚数を増やせばいいだけなので。

PBSTは試薬ビンにいれていたので、そのままふたを固定する感じで、中央に置いていました。

(無題)

削除/引用

No.383-18 - 2011/05/11 (水) 23:49:00 - ＫＴ

> Transfer bufferについて
> 組成はどのようになっていますか？

おっしゃるとおり、ＳＤＳの泡が怖くて加えていません。
しかし、分子量が大きい時は加えた方がよいのでしょうか。
次回試してみます。

> ディスポの5mlピペットなどを適当な長さに折ってろ紙のうえから軽く押さえコロコロ転がすとあわが抜けます。

ATTOのＨＰではコロコロはムラの原因と書いてあったので、上から押さえるようにしました。しかし、実際のところは前者の方がよさそうな気もします。

> また、Millipore社のHP上にいくつか参考になる部分があるので見て頂けると幸いです。
> http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteintransfer

情報ありがとうございます。チェックします。

(無題)

削除/引用

No.383-17 - 2011/05/11 (水) 23:38:46 - もりなが牛乳

Transfer bufferについて
組成はどのようになっていますか？
私達は100kDaより大きい分子を転写する際、Towbinに0.1%SDSを加えています。
SDSが濃すぎるとの意見もありますが、経験上大きな問題はありません。
また、SDSでmembraneとgelの間に泡が入ってしまうことがありますが、
ディスポの5mlピペットなどを適当な長さに折ってろ紙のうえから軽く押さえコロコロ転がすとあわが抜けます。
また、Millipore社のHP上にいくつか参考になる部分があるので見て頂けると幸いです。
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteintransfer

確かに・・・・

削除/引用

No.383-14 - 2011/05/11 (水) 22:25:05 - ＫＴ

> 使い込んで白い水垢のようなものが出来ているようでしたら、ステンレス板だけ交換可能です。ゴシゴシすると傷がついて良くないです。マイナス極が汚れていると、転写ムラになりやすいと感じます。

マルチユーザーで長年使用しているため、汚いです。交換について相談してみます。

> １）140kDaのタンパクであれば、ゲルの濃度を8%程度に低くするのがよろしいです。

ゲルは5~20%のグラジエントを使用しています。自作すると濃度ムラが生じて涙をのんだことがよくありましたが、頑張って８％調整してみます。

> ２）電流（か、電圧）を1/10から1/15程度に低下させて、室温で一晩転写すると、高分子領域の転写がいくらか良くなります。

今は１５Ｖで６０分ですので、１Ｖ程度に下げて一晩ということですね。
ちょっと多めのバッファーで焦げ付かないようにしたらいけますかね。

> ３）文献を調べるとTris/Tris/Tris-animocaproic acidのバッファー系があります。セミドライで転写効率を追求するなら、Tris-Gylよりもかなりよいです。

知りませんでした。調べてみます。情報ありがとうございます。

(無題)

削除/引用

No.383-13 - 2011/05/11 (水) 22:17:01 - qq

＞マイナス極はステンレスみたいです。
使い込んで白い水垢のようなものが出来ているようでしたら、ステンレス板だけ交換可能です。ゴシゴシすると傷がついて良くないです。マイナス極が汚れていると、転写ムラになりやすいと感じます。
泡を噛んでいるのは、努力して丁寧にセットすることで解決するとして、それ以外の点として、
１）140kDaのタンパクであれば、ゲルの濃度を8%程度に低くするのがよろしいです。
２）電流（か、電圧）を1/10から1/15程度に低下させて、室温で一晩転写すると、高分子領域の転写がいくらか良くなります。（万が一、液が乾いて事故が起きないとか限りません。私はよくやっていますが、責任は持てません。）
３）文献を調べるとTris/Tris/Tris-animocaproic acidのバッファー系があります。セミドライで転写効率を追求するなら、Tris-Gylよりもかなりよいです。（でも、面倒です。）

気泡というか・・・

削除/引用

No.383-11 - 2011/05/11 (水) 22:00:43 - ＫＴ

> 手で押しても、基本的に空気に抜きはできない、と思います。
> もし、膜の上にゲルを置いているのなら、気泡がないことをよーくチェックします。あればセットしなおしです。
> 膜ーゲル　の上下のろ紙はしっかり濡らし、気泡がないようにセットします。

running gelの泡がよく混じるので、トランスファーバッファーですすぎ洗いをしてから泡を落としてからセットしています。
おっしゃる通り、手で押しても空気が残るばかりか、ゲルが歪んで却って汚い転写になるような気もします。
semi-dryでは気泡が新たに生じやすいのでしょうか？？

(無題)

削除/引用

No.383-8 - 2011/05/11 (水) 20:18:56 - 暇なし

手で押しても、基本的に空気に抜きはできない、と思います。
もし、膜の上にゲルを置いているのなら、気泡がないことをよーくチェックします。あればセットしなおしです。
膜ーゲル　の上下のろ紙はしっかり濡らし、気泡がないようにセットします。

重しというのは・・・・・

削除/引用

No.383-5 - 2011/05/11 (水) 19:33:45 - KT

> メンブレン、ゲル、濾紙は同じ大きさである事。
> マイナス極の蓋を乗せる時に平行状態である事。
> 蓋の上に重しを置く事。

大きさの件は了解しました。
重しというのは、上蓋以外に、マイナス極の鉄板の上から直接何かをのせるということでしょうか？

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。