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(無題) 削除/引用 No.376-10 - 2011/05/11 (水) 12:33:34 - ああ GFPブリーチングについてありがとうございます。面白そうで、難しそうですね。いろいろ方法があるものなんですね。 既に挙げられた遠心分画したオルガネラを使って小胞状の染色が見られるか見てみるのも分かりやすいかもしれませんね（どのくらい難しいのか分かりませんが）。オルガネラマーカーとか一緒に染色すると面白そうです。

(無題) 削除/引用 No.376-9 - 2011/05/11 (水) 10:29:01 - あべちゃん >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:4] あべちゃんさんは書きました : > > > わたしは、これで細胞質成分を洗い流してます。 > > > あべちゃんさん > これは主にミトコンドリアでしょうか?どのような部位のものが残りますでしょうか? これは昔の仕事で、核膜です。 最近はミトコンドリアに執心してますが、免疫染色はやってません。

(無題) 削除/引用 No.376-8 - 2011/05/11 (水) 09:45:50 - あ アドバイスをありがとうございます。 遠心分画してウエスタンすると、オルガネラの膜画分に少し検出されます。こちらが活性型で細胞質がアイドリングしているタンパクでは？と考えているのですが、免疫染色で、オルガネラにいることを示せ、と言われています。 GFPのブリーチングは細胞の端の方をブリーチすれば、可溶性で細胞質に拡散している分子が退色して、オルガネラに結合した分子の蛍光だけのこらないかな、と考えてみました。 固定前に、Triton処理で洗い流せるのですか。。。自分のタンパク質まで溶け出てしまうかな？と思っていたのですが、膜タンパク質全般に、細胞に残りますか？ ジギトニンとTriton、調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.376-7 - 2011/05/11 (水) 05:15:46 - おお >[Re:4] あべちゃんさんは書きました : > わたしは、これで細胞質成分を洗い流してます。 あべちゃんさん これは主にミトコンドリアでしょうか?どのような部位のものが残りますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.376-6 - 2011/05/11 (水) 01:11:51 - ー >膜上と細胞質の両方に存在 これはどのようにして分かったのですか？もし先行研究からでしたら、既に方法が報告されてないのでしょうか？

アイデア 削除/引用 No.376-5 - 2011/05/11 (水) 01:08:17 - ああ 膜を染色してFRETとか言うのはどうでしょうか？無理かな。 ところで、GFPヒュージョンの細胞質ブリーチってどんな方法ですか？

pre-permeabilization! 削除/引用 No.376-4 - 2011/05/10 (火) 17:36:53 - あべちゃん 0.Cells grown on coverslip in 6-ewll dish 1.Wash w/2 ml ice-cold PBS, twice 2.Prepermeabilization on ice, 10 min by 2mL ice-cold 0.1% Triton X-100 buffer 3.Wash w/2 ml ice-cold PBS, twice 4.Fixation on ice, 10 to 20 min, 2 mL ice-cold 3.7% fomalin + 0.25% glutaraldehyde in 1X PBS 5.Wash w/2 ml PBS 6.Quenching at RT, 15 to 30 min (rotation), 2 ml 0.1 M glycine in 1XPBS 7.Wash w/2 ml PBS 8.Permeabilization at RT, 5 to 10 min, 2 ml 0.5% Triton X-100 buffer 9.Wash w/2ml PBS, twice わたしは、これで細胞質成分を洗い流してます。

(無題) 削除/引用 No.376-3 - 2011/05/10 (火) 17:12:09 - おお 当てにならないあてすっぽのアイデアということでちょっと書かせてもらいます。ジギトニンとか細胞にあなを開けるでタージェンとがありますよね。これで細胞膜に穴をあけて、PK処理をして洗ってからこていするとどうでしょうか。 オルガネラ膜に存在してPKプロテクティブな部分がその抗体の抗原として働くならそこにとどまったタンパクが検出できますよね。

(無題) 削除/引用 No.376-2 - 2011/05/10 (火) 16:12:52 - ~ 装置があるかどうか次第ですが、共焦点レーザー顕微鏡を借りられませんかね。 光学切片であれば、細胞膜のシグナルは除けますよね。 オルガネラ画分で実験することは出来ませんかね。 タンパク質自体はタグ無しでできますよね。

細胞内膜タンパク質の免疫染色 削除/引用 No.376-1 - 2011/05/10 (火) 15:36:53 - あ 細胞内オルガネラの膜に結合するタンパク質の免疫染色をしています。 膜上と細胞質の両方に存在するのですが、細胞質のシグナルが強いため、オルガネラ膜のシグナルを判別することができません。膜に結合した分子だけを染色、可視化することはできないでしょうか。 GFPヒュージョンの細胞質ブリーチも可能とはおもうのですが、タグなしか内在性タンパク質で実験するように指示されていて、いい方法があったら教えていただきたいです。よろしくおねがいします。

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