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(無題) 削除/引用 No.375-12 - 2011/05/30 (月) 13:33:50 - おお 表面にある電荷の違いということで、修飾かもしれませんそれだとそこまで負電荷に大きな差がでるなら、可也たくさん変化がある可能性があります。 もう一つ考えられることは構造の違いでイオン交換のかんのうきがアクセスできないばあい。複合体形成とか、場合によっては可溶でもあグッている事もあるかもしれません。 乗せるタンパク量が過剰ということはありませんよね。

(無題) 削除/引用 No.375-11 - 2011/05/29 (日) 19:40:55 - posca DEAEに変更後、かなりの量がフロースルーに落ちますが、0.4M-0.8M NaClにて溶出できました。 みなさまアドバイスありがとうございました。 今後、pH条件（現在pH7.8）を検討して、収率をあげていこうと考えています。 疑問なのですが、フロースルーで落ちてくる大部分のこのタンパクと塩濃度を上げることで溶出してくるこのタンパクの挙動の違いは、電荷の違いからきていると思うのですが、その差はどういう理由で起こるのでしょうか。 教えていただけると幸いです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.375-10 - 2011/05/11 (水) 19:01:32 - Boston-Pullman タンパク質精製をしていた昔、いきなりカラムでは無く、バッチ法で条件検討していました。 その時に確認のために溶出後のレジンにサンプルバッファーを加えて、CBB染色していたので。

(無題) 削除/引用 No.375-9 - 2011/05/11 (水) 15:37:46 - ~ >[Re:8] Boston-Pullmanさんは書きました : > オープンカラムならば、最上部のレジンを回収して、WBするとかで本当に溶出されていないのか分かります。分解とか抗原性が変わったとか気になったので。 オートクレーブ可で界面活性剤耐性のイオン交換樹脂が売っていますよね。 溶出していないだけであれば、温めたSDS入りのTris-Glycineバッファーあたりで溶出できませんかね。

(無題) 削除/引用 No.375-8 - 2011/05/11 (水) 13:48:53 - Boston-Pullman オープンカラムならば、最上部のレジンを回収して、WBするとかで本当に溶出されていないのか分かります。分解とか抗原性が変わったとか気になったので。

(無題) 削除/引用 No.375-7 - 2011/05/11 (水) 13:30:02 - posca てさん 透析後のサンプルは、ウエスタンで確認しています。 透析とカラムの平衡化のバッファー組成の違いについてですが、最初は両方とも同じ組成で行ったのですが、溶出できませんでした。そこで、平衡化の際のバッファーに含まれているureaが障害になっているのではないかとアドバイスをいただき、現在のバッファー組成でおこないました。

ないとは思いますが 削除/引用 No.375-6 - 2011/05/11 (水) 00:58:26 - て 可能性はないと思うのですが、参加させてください。 透析後サンプルを回収できたことは電気泳動で確認されておられますでしょうか？ あと興味をひかれたのですが、透析とカラムの平衡化の緩衝液組成が異なるのはどうしてですか？一般的にそういうものなのでしょうか？経験がなく興味をひかれましたのでお教えいただけますと幸いです。

検討してみます 削除/引用 No.375-5 - 2011/05/10 (火) 18:20:22 - posca 大変参考になります。 Expasyというサイトで調べると、pI:7.44でした。 まず、グアニジンSCNでの溶出を行い、DEAEでの精製を検討してみようと思います。 ありがとうございました。

検討してみます。 削除/引用 No.375-4 - 2011/05/10 (火) 18:06:39 - posca

(無題) 削除/引用 No.375-3 - 2011/05/10 (火) 17:45:54 - おお pIはシュガーの修飾とか、どこかで切断されるけど場所がはっきり決まってないとか、電気えいどう(SDSPADE)のいちから分子量などから修飾を疑っているとかでしょうかね。 抗体からタンパクを捕らえるというアプローチはありますのでそれならpIは検討つかない場合もありますが、わざわざ細胞に発現させていますので遺伝子はおもちなのではとおもえますが。 いずれにしろタンパクのpIはイオン交換で基準にするというという発想もありますが私は全くそれについては気にしません。+と-のチャージの量が一緒でもそれぞれのチャージが手を組んで全く電荷を持たないと言う事は先ずないので。 くっついて取れないという解釈ですよね。イオン交換は確かに弱いものを使った方がこう言う場合はいいかもしれませんね。そのくっついたやつはグアニジンSCN 4ー6Mで外れないでしょうかね。尿素のように変性、疎水結合を外す能力がある上に電離しますので、過剰の塩を加えるひつようがありません。それで出てくるなら溶出条件がわかったわけですからその条件でいけますよね。疎水性の強いタンパクをイオン交換で分ける時カラムとの疎水的な相互作用を考慮してカオトロピックイオンを利用することがしばしあります。 あるいはpHをおもいっきり下げておいて、有機溶媒を利用する手もあるかもしれませんが支持体を選びますね。 pH6は落ちてこないのでここまで下げてるっですよね。上げるとチャージのバランスがかわって可溶性になると言うことはないでしょうか(カラムに強くつくとかではなくて)。 カラムを変えるなら、そのタンパクとのとの相互作用がないか扱えるほど弱い支持体を探さないとやりにくいですよね。

(無題) 削除/引用 No.375-2 - 2011/05/10 (火) 17:09:00 - ~ そもそも細胞に発現させてウエスタンで見れるのにpIが分からないというのがよく分かりません。 リン酸基等が付く可能性があるタンパク質という意味でしょうか？ そうであれば、イオン交換カラムだと修飾基の有無でピークが分かれるかもしれませんので、ゲルろ過などの方が影響は少ないのではないでしょうか。 まずはバッファーのpHを変えたら改善しませんか？ イオン交換カラムの正攻法だと思います。 DEAEのような弱いイオンカラムや、疎水性のカラム等、タンパク質精製に用いられる他のカラムが手持ちにあれば、試してみてはいかがでしょうか。 WBができる抗体を使えば、アフィニティーカラムで精製ができるかもしれません。 （コストがかかりますが） そのカラムを使ったことが無いので耐薬品性が分かりませんが、イオン交換カラムで、2プロパノール、ACN、EtOHなどを溶出液に混ぜるプロトコルもありますよね。 もっと極端だと、グアニジンで洗浄するプロトコルもありますよね。 2MのNaClで洗った後で、それらで溶出できませんかね。

イオン交換クロマトグラフィーで溶出できない 削除/引用 No.375-1 - 2011/05/10 (火) 14:52:43 - posca いつも拝見させていただいています。 今回、あるタンパクをイオン交換クロマトグラフィーで精製中なのですが、溶出できない状態であり、アドバイスをいただきたいと思い、トピックを作成しました。 Sf9細胞で発現させ、遠心で得られたペレットを、lysis buffer(8M urea,20mM phosphate buffer,500mM NaCl,TritonX1%,pH7.8）で可溶化し、得られたサンプルを脱塩およびpH変更のために、buffer(8M urea,20mM phosphate buffer,TritonX1%,pH6.0)で透析しています。その後、 強陽イオンカラム（High s:BIORAD）をbufferA(20mM phosphate buffer,TritonX1%,pH6.0)で平衡化し、サンプルロード後、buffer A をNaCl 0-2.0Mで調整し、ステップワイズ法にて溶出を試みました。フロースルーおよび各NaCl分画にて、ウエスタンで確認したのですが、溶出を認めませんでした。このタンパクのpIは不明です。得られるタンパクの活性は問いません。平衡化および溶出bufferに8Murea を加えた場合も検討しましたが、溶出を認めませんでした。 溶出するのに必要な条件やカラム選択などでアドバイスあれば、よろしくお願いします。

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