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(無題) 削除/引用 No.366-5 - 2011/05/10 (火) 06:13:44 - おお きっとを使っているようなのでキットが使っている溶液や手法を把握しないとなんともいえませんが、典型的な核たんぱく質抽出法は低調(場合によってはデタージェントいり)で細胞膜をこわし、サイトゾルのタンパクをバッファーに放出させ核を回収して、その核に400mMくらいの塩(KClなど)を加えて塩によるタンパク抽出するのがメジャーなやり方です。 この時この様な高い塩濃度で比較的核(細胞の数)が少ない時クロマチンも完全に解けてDNAが溶出してしまう事があります。デタージェントが気になる時はなしでやるてもあります。また塩によるクロマチンの耐性は細胞によって若干変わってくるかもしれません。細胞を増やすか核抽出ようバッファーを減らすといいかもしれません。 それでもどうしてもDNAがでるようでしたら、核タンパク抽出の時にグラスビーズをいれて緩くボルテックスするとDNAは吸着性が高いのでうまく行けば分離するかもしれません。ただ核たんぱく質の活性を測るような目的でこの様な手を使ったことがないので保障はできません。 細胞の調子が悪いと死細胞のDNAが溶出してくることもありますのでもしなにか心当りがあれば確認してみてください。 DNaseをつかうてはありますが、あとでDNAを使った実験などをするようでしたら厳しいかもしれません。

蛋白によるけど 削除/引用 No.366-4 - 2011/05/09 (月) 18:39:26 - ema 私はどうしても核のDNAがどろどろになるので、蛋白の種類によりますがSonicationもしくはDNAseをかけました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.366-3 - 2011/05/07 (土) 19:30:07 - rainbow 確かに、固まりはDNAにも似ていますが、糸をひく感じではなく餅のようにぶよぶよしている感じです。 もしDNAであれば、DNAaseを入れたりするともう少し良い状態になるのでしょうか…。 ひとまず、御指摘のようにDetergentを他の種類のものに変えたり、時間を変えてみようかと思います。 色々お教えいただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.366-2 - 2011/05/07 (土) 11:20:24 - ABZO 半透明のどろどろの固まりはたぶんDNAだね。チップでいじると糸引いたりしないかな。ということは細胞膜を溶かすDetergent入れた時点で核膜やクロマチン構造も壊れて出てきてしまってるとうい事かな。それだと核画分（と一応考えている）ペレットには見たいものあんまり残らないかもね。だからむしろ激しい処理は逆効果かもね。組織とかだと同じようにやっても核の回収率とか純度とか組織の種類で結構違うよ。細胞もそういうのがあるのかもね。ある程度純度が悪くなっても確実に回収できる方を優先した方がいいとおもう。あとどうせdetergent処理するなら別に低張液でなくても普通の等張bufferでいいのではないかとおもうんだが。あとキットだからあれだけどdetergentはNP-40とかTX-100とかかな。核膜はあまりダメージ与えなず周りの小胞体とかくっているやつは溶かすということで、きれいな核をとるのによくつかわれるけど、それも程度問題で、処理が長過ぎたりすればやっぱ影響あるよ。たとえばDetergentをもう少し弱いジギトニンとかにしてみるとかして核膜の破壊を最小限にするとかどうかな。

好中球からの核タンパク抽出方法 削除/引用 No.366-1 - 2011/05/06 (金) 10:47:04 - rainbow いつも参考にさせていただいています。 ヒトの末梢血の好中球の核タンパクを抽出し、転写因子活性をみたいと思っています。 Active motifのnuclear extract kitを用いて、まず低張液で細胞を膨張させて、Detergentで細胞膜を破壊し、その後核ペレットをLysis bufferで溶かすという方法です。 通常は、Detergentを加えた時点で顕微鏡下に細胞の可溶化が確認できるようなのですが、どろどろした半透明のゲル状の塊ができ、うまく可溶化できません。 その後Lysis bufferを加えても同じ状態で、十分量の核タンパクが抽出できません。 今まで他の人が筋芽細胞やTHP-1などの細胞で同じキットを用いて核タンパクを抽出したときは、そのような問題はなかったようです。 キットの製造元に問い合わせて、上の工程に加えてダウンス型ホモジナイザーで可溶化することを試みましたが、顕微鏡下で多少断片化はされたものの、やはり十分量のタンパクが抽出できませんでした。 どなたか同じような実験のご経験がある方で、解決方法などご存じの方がいましたらお教えいただけますと幸いです。

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