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(無題) 削除/引用 No.361-10 - 2011/05/10 (火) 01:27:24 - iconi9 >[Re:7] おおさんは書きました : > ゲノムDNAは量を測って10ngほど使えばいいかと思います。これでマンマルでもうまく行くのでもっと少なくてもいいともいえます。 ゲノムDNA濃度を測定したところ、PCRに使うDNA量が多すぎる事がわかり、ご指摘を参考にDNA量を大幅に減らしたところ、無事にPCRがかかりました。 みなさま、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.361-9 - 2011/05/06 (金) 09:36:27 - ~ >PCRでなく、ゲノムDNAの間違いです。抽出したゲノムDNAを電気泳動で確認してきれいの間違いです。 おそらく今回のトラブルシューティングの解決には繋がらないと思いますが、 ゲノムDNAを流してきれい汚いというのはどのような結果だったのでしょうか？ 酵母からのゲノムDNA抽出だと、ゲノムDNA以外の何かが見えるのが普通なのでしょうか？ >プロトコールに基づいてカセット全長を見ています。 貴方の作業の目的はそのプロトコルに従うことなのでしょうか？それとも目的遺伝子が組み込まれた株を得ることでしょうか？ 従わなければならないほどきちんと作られたプロトコルであれば、その前段階としてのゲノムDNA抽出法もプロトコルがあり、きれい・汚いと判断できるほど差のある材料を使うこと自体がおかしいと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.361-8 - 2011/05/05 (木) 18:08:04 - 310 多分無いと思いますが、ゲノムDNAのPCR用ワーキングソリューションにTEを使っていますか？普通は高濃度gDNAストック用はTEでも、PCR用に希釈するときはTrisだけとかdH2Oにするので、EDTAの影響は考慮しなくていいのですが。PCR溶液にTEが直接入るようだと、Mgイオンが最適な濃度よりうすくなることがあります。

(無題) 削除/引用 No.361-7 - 2011/05/03 (火) 04:50:41 - おお 不純物の持ち込みもによる阻害の心配もした方がいいとは思いますが、酵母でもコロニーをつついてコロニーPCRして2kbとか増幅したりしますからねェ。 ちゃんと精製したものであれば容量の多い少ないはあまりクリティカルではないと思いますけど。4kb弱の増幅なのでゲノムを電気えいどうでながして20kb以上にのサイズにバンドが見れるならまずよしでしょう。もちろんサイズは大きい方がいいですけど。 ゲノムDNAは量を測って10ngほど使えばいいかと思います。これでマンマルでもうまく行くのでもっと少なくてもいいともいえます。 増幅するDNA断片が長いので条件設定が微妙かもしれませんね。タッチダウンとかもやってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.361-6 - 2011/05/02 (月) 21:14:31 - 弘法 酵母はゲノムサイズが小さいので、genomic PCRとしては容易であると言って良いと思います。vortex云々が問題になるとは思えません。 DNAはどのように調製していますか？私も~さんと同じく共雑物による阻害を疑います。加えたDNAの量（容量ではなくμg）はどのくらいですか？

(無題) 削除/引用 No.361-5 - 2011/05/02 (月) 20:23:17 - iconi9 > > 　10ulの系でDNAは2ul加えています。 > 私は20%の持込量は多目（というかほぼ上限）と思っています。 やはり上限でしたか。私も20％が上限ではと考えていました。 > PCR反応を阻害するゴミと呼ばれるのは、核酸以外の成分だと思います。 > 単なるアガロースゲル電気泳動＋エチブロ染色等であれば、核酸以外は検出されないと思いますが、何を検出できる電気泳動をされたのでしょうか？ > それとも、残存しているRNAをゴミと呼んでいるのでしょうか？ > そうであれば、PCRのテンプレートを精製する際にはRNase処理のステップは入れておいたほうがいいと思いますが。 RNase処理は行いました。おっしゃる通り、アガロースゲル電気泳動＋エチブロ染色で確認しています。 > > >１回目よりも２回目のPCRの方がきれいでした すみません。PCRでなく、ゲノムDNAの間違いです。抽出したゲノムDNAを電気泳動で確認してきれいの間違いです。 > また、酵母だと発現用のカセットの全長を見ないと発現株が効率よく拾えないほど断片化して入ることが多いのでしょうか。 プロトコールに基づいてカセット全長を見ています。 > 動物細胞であれば、薬剤耐性でセレクションすれば、とりあえずノーザンブロットかSDS-PAGEで見ようと思えるくらいの頻度で発現株が得られているので、わざわざPCRで全長を増やす必要性がよく分かりません。 > PCRするにしても、ベクターとインサートのギャップ部分（必要であれば5'と3'の2ヶ所）をPCRで増やすことで、もう少し簡便にスクリーニングをすることが出来ると思いますが。 私も薬剤耐性でセレクションしようと思ったのですが、ボスの方針で一応ゲノミクＤＮＡで確認した方がいいとの事でやっています。

(無題) 削除/引用 No.361-4 - 2011/05/02 (月) 16:03:13 - ~ >[Re:3] iconi9さんは書きました : > 増やしたい断片は3.6kbです。 3.6kbは長めのPCRと呼べると思います。 DNの断片化は避けるべきだと思いますが… > 　10ulの系でDNAは2ul加えています。 私は20%の持込量は多目（というかほぼ上限）と思っています。 >電気泳動をした限り、ゴミはかなり除去できていますし PCR反応を阻害するゴミと呼ばれるのは、核酸以外の成分だと思います。 単なるアガロースゲル電気泳動＋エチブロ染色等であれば、核酸以外は検出されないと思いますが、何を検出できる電気泳動をされたのでしょうか？ それとも、残存しているRNAをゴミと呼んでいるのでしょうか？ そうであれば、PCRのテンプレートを精製する際にはRNase処理のステップは入れておいたほうがいいと思いますが。 >１回目よりも２回目のPCRの方がきれいでした。 「PCRの方がきれい」というのは「非特異バンドの本数・濃さが少ない」という意味なのでしょうか？ PCRを阻害する物質が混入した場合、非特異バンドの合成も阻害されるでしょう。 そのため、「2回目のテンプレートは目的バンドはおろか、非特異バンドすら増えないほど阻害物質の持込量が多い汚いDNAだった」と解釈することも出来ると思いますが… また、酵母だと発現用のカセットの全長を見ないと発現株が効率よく拾えないほど断片化して入ることが多いのでしょうか。 動物細胞であれば、薬剤耐性でセレクションすれば、とりあえずノーザンブロットかSDS-PAGEで見ようと思えるくらいの頻度で発現株が得られているので、わざわざPCRで全長を増やす必要性がよく分かりません。 PCRするにしても、ベクターとインサートのギャップ部分（必要であれば5'と3'の2ヶ所）をPCRで増やすことで、もう少し簡便にスクリーニングをすることが出来ると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.361-3 - 2011/05/02 (月) 14:52:43 - iconi9 >[Re:2] ~さんは書きました : > そもそも、増やしたいサイズが書かれていませんので、断片化したほうがいいのか、断片化を避けるべきなのかは答えようがない質問だと思いますが。 増やしたい断片は3.6kbです。 > １．ゲノムDNAを持ち込みすぎない > 　足りない心配よりも、入れすぎを心配しましょう。 ここが1番気になりました。電気泳動で抽出したゲノムDNAを電気泳動で確認した時、1回目の方がバンドが薄かったため、2回目はゲノムDNAを入れすぎた可能性が高いです。 > ２．抽出時は、収率よりもごみの除去を優先 > 　ゲノムDNAをたくさん回収することより、ごみや塩を除くことを重要視しましょう。 > 　汚い場合に、ゲノムDNAを希釈することでPCRで増えるようになることがあります。 　10ulの系でDNAは2ul加えています。電気泳動をした限り、ゴミはかなり除去できていますし、１回目よりも２回目のPCRの方がきれいでした。

(無題) 削除/引用 No.361-2 - 2011/05/02 (月) 12:00:17 - ~ 酵母でのPCRの経験はありませんが。 >一般的にゲノミックPCRは増幅する条件が難しいのでしょうか？ 比較対象がプラスミドをテンプレートとしたPCRであれば、ゲノミックPCRの方が難しいと思います。 比較対象がcDNAをテンプレートにしたものであれば、ゲノミックPCRの方が簡単だと思います。 >軽くvoltexして断片化した方が増幅効率が良いとあったのですが、どうでしょう？ そもそも、増やしたいサイズが書かれていませんので、断片化したほうがいいのか、断片化を避けるべきなのかは答えようがない質問だと思いますが。 動物細胞でのゲノミックPCRでは、断片化をあえてしたことはありません。 酵母の方がおそらくゲノムサイズは小さいですよね。 気になるのは １．ゲノムDNAを持ち込みすぎない 　足りない心配よりも、入れすぎを心配しましょう。 ２．抽出時は、収率よりもごみの除去を優先 　ゲノムDNAをたくさん回収することより、ごみや塩を除くことを重要視しましょう。 　汚い場合に、ゲノムDNAを希釈することでPCRで増えるようになることがあります。 ３．どの結果が正しいかどうかを考えられるように、適切なコントロールを用意する。 　1回目でポジティブな結果が得られたゲノムDNAをポジコンに使えたはずでは？ 　1回目にPCR1回分しかとっていなかったのであれば、今後はもう少し増やしてから回収するようにしてはいかがでしょうか。 あたりです。

ゲノミックPCRのポイント 削除/引用 No.361-1 - 2011/05/02 (月) 11:30:26 - iconi9 いつも勉強させていただいています。 私は酵母でのタンパク質発現のため、目的遺伝子を酵母のゲノムDNAに導入した後、ゲノムDNAを抽出してPCRを行い、目的遺伝子の確認を行いました。その結果、1回目はPCRで増幅を確認しましたが、非特異的バンドも見えました。その後、再度ゲノムDNAを抽出してPCRをかけたところ、今度は増幅が確認できず、再現性が得られないという結果になりました。反応試薬の入れ忘れはありません。 一般的にゲノミックPCRは増幅する条件が難しいのでしょうか？また、軽くvoltexして断片化した方が増幅効率が良いとあったのですが、どうでしょう？確かに、私は1回目の時はエタ沈の時に軽くボルテックスして沈殿を溶かしました。ゲノミックPCRのコツなどを教えて頂ければ幸いです。よろしくおねがいします。

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