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(無題) 削除/引用 No.353-12 - 2011/05/07 (土) 10:46:55 - モンブラン おお様、組織様 ご連絡遅くなり大変失礼しました。自分でPFA固定とアセトン固定を比較したところ、PFA固定ではシグナルが得られなかったのに対し、アセトン固定では特徴的なシグナルが得られた感じです。 おっしゃる通り、ネガコンやポジコンをおけば比較しやすいのですが、現在そのようなツールもなく、なかなか難しいという印象です。今回はアセトン固定を30分と長くやってしまったため、細胞が一部ボロボロになってしまいました。もう一度、適切な条件で染色して様子を伺いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.353-11 - 2011/05/02 (月) 16:40:00 - 組織 おっしゃる通り、有機溶媒により抗原が流出する可能性、抗原の局在が変わる可能性は考慮すべきだと思います。説明不足ですみません。経験的には、膜タンパクに対しても有機溶媒が有効なことが多いんですが、今まで使ってきたのは白血球マーカーが比較的多いので、そのへんも考慮すべきなのかもしれません。 免疫染色は、何を染めてるかわからないけど光ってるというのが一番怖いので、有機系とアルデヒド系の両方で染めて、染色パターンを比較したり、可能な限りポジコンやネガコンを置くようにする、といった対応策が必要でしょうね。 あと、アセトンと、アセトン：メタノールの違いはあまりないかもしれませんので、ご了解ください。

(無題) 削除/引用 No.353-10 - 2011/05/02 (月) 11:42:24 - おお だれを攻めるわけでもないですが、私の感覚ということで書かせていただきます。 膜タンパクということなので、有機溶媒を使った固定は脂質を溶解して膜を溶かしてしまうような印象があります。なのでタンパクがどの様に固定されて残るのかなぁとおもいます。次に固定後にデタージェントを使うと変性して固定したタンパクが溶け出てしまうという不安もあります(必ずしもデタージェントを使うわけでもないと言うことも存じ上げてますが)。というのはPFAなどはクロスリンクさせるので、単独で溶け出るようなことはありません。ただ有機溶媒でうまく行く場合もあるんだと思います。結局は経験則なんですが、最近各メーカー推奨固定法を各抗体について書いていたりします。もしそうならそう言うのもチェックしてみるといいかもしれません。 加えてまず染まっているわけですから、ネガコンやそれに相当するような材料がないか考えて見るべきかともおもいました。同じような膜局在性を示すほかのタンパクで染めたイメージが公表されているののとか、そのタンパクの細胞外のドメインを認識できるような交代があれば比較することによりもっと確信がもてるようになるとは思いますが如何でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.353-9 - 2011/05/02 (月) 10:57:58 - モンブラン 組織様 体験談を基にされたアドバイス、説得力があり大変参考になりました。今回はアセトンのみで固定しましたが、今後はアセトン：メタノールもやってみたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.353-8 - 2011/05/02 (月) 09:31:05 - 組織 >[Re:7] モンブランさんは書きました : > 有機溶媒による固定はまさに検討中です。これでうまくシグナルが見れればいいのですが。逆に質問になってしまうのですが、有機溶媒による固定に変えることで、PFAなどとは染色像が明確に変わることがあるのでしょうか。 アルデヒド系と有機系で染色態度が大きく変わることはままあります。なので、新しい抗体を使う時は、必ず両方の固定法を試します。私の経験上、アセトン：メタノールが一番よく染まります。逆に、アルデヒド系じゃないとだめな時もあります（一部のサイトケラチンなど）。 > 今回も結果が怪しければ賦活化なども試してみようと思うのですが、それらについても何かご存知でしたらご助言いただけると幸いです。 培養細胞で賦活化をしたことはありません。それよりは固定法を変えた方が効果的かと思います。

(無題) 削除/引用 No.353-7 - 2011/05/02 (月) 09:17:19 - モンブラン 組織様 ご連絡ありがとうございます。 有機溶媒による固定はまさに検討中です。これでうまくシグナルが見れればいいのですが。逆に質問になってしまうのですが、有機溶媒による固定に変えることで、PFAなどとは染色像が明確に変わることがあるのでしょうか。 今回も結果が怪しければ賦活化なども試してみようと思うのですが、それらについても何かご存知でしたらご助言いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.353-6 - 2011/05/02 (月) 08:29:36 - 組織 有機溶媒による固定が有効な場合があります。 アセトン：メタノール（1：1）で４度10分くらい固定しています。

(無題) 削除/引用 No.353-5 - 2011/04/29 (金) 16:36:07 - モンブラン たしかに膜タンパクを染めているので、上下のシグナルが混ざるとボヤっとした見にくい像になるかもしれないですね。言われて納得しました。とりあえずコンフォーカルでもトライしてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.353-4 - 2011/04/29 (金) 16:31:26 - おお 物によると思いますが、実際にどの程度イメージがかわるかはあまり経験豊富でありませんので何ともいえません。通常の蛍光顕微鏡では細胞の上にある膜、下にある膜、すべてのシグナルがカメラにとどきます。そうすると細胞全体が染まっているように見える可能性があるだろうなぁと想像しています。

(無題) 削除/引用 No.353-3 - 2011/04/29 (金) 15:32:44 - モンブラン おお様、ご回答ありがとうございます。 どうやら固定液をPFAからPLPに変更して検討する価値がありそうですね。イメージは通常の蛍光顕微鏡になります。改めてコンフォーカルで取り直してみようかと思いますが、実際に見え方が変わってくるものなのでしょうか。素人な質問ですいません。 シグナルに差が見られないというのは、今回とは別の種類の抗体で膜タンパクを染めたときは核が抜けたキレイなシグナルが得られたので、客観的にそれと比べて差がないという表記をしてしまいました。今回の染色像は全細胞集団のなかで所々がボヤっともやがかかったように染まりました。実際、目的タンパクは均一に分布しているものでないのでそのもやがかかったようなところにいるのかもしれませんが、どうも染色像が怪しくて投稿させていただきました。 膜タンパクの免疫染色自体、経験が少ないのですが、こういうボヤっとした染まり方もよく見られるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.353-2 - 2011/04/29 (金) 15:20:11 - おお イメージはコンフォーカルですか、それとも通常の蛍光顕微鏡ですか。差が見られないと書いてますが何に関して見られないのですか? 膜タンパクなどの固定は昔にもよく出てきています。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=2673

表面タンパクの免疫染色 削除/引用 No.353-1 - 2011/04/29 (金) 14:46:41 - モンブラン いつも参考にさせていただいてます。以前も似たような投稿があったのですが、過去トピが見れなかったので質問させていただきます。 当方、現在培養細胞の表面タンパクを免疫染色しているのですが、なかなかうまくシグナルが得られません。使用抗体は表面タンパク(膜貫通)の細胞質側を認識するものです。 染色では4%PFAを30分行なったあと、0.3%Tritonもしくは0.1%saponinで膜透過を1時間行い抗体反応を行ないました。膜貫通の細胞質側を認識するため、tritonとsaponinの二つを検討してみたのですが、明確な差が得られませんでした。結果はどちらも膜タンパクというよりはボヤっとしたシグナルがベタっと染まってる感じで、何とも言えない状態です。 膜タンパクの染色はいろいろコツがいるというのを調べてみて知ったのですが、有機溶媒による固定や抗原の賦活化など、膜タンパクを検出する際に行なったほうがいいことをアドバイスしていただけると幸いです。また、いくつか条件検討も必要かと思いますが、できればどういった条件を振って行なうのが理にかなってるかなど、よろしくお願いします。

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