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(無題) 削除/引用 No.333-22 - 2012/02/02 (木) 13:08:36 - AP ２０１２年版のフォーラムに引越し済みですよー 1) ガラス電極を30分ほど過酸化水素水に浸して除染しする、ということをやっていたことがあった。 2)TrisのpKb値から、目的のpHにするためのTrisとHClのモル数を計算して、最初からそれにしたがった分量で調製する。あるいはTrizma baseとTrizma HCl（Sigma)の溶液を作って、テーブルにしたがって目的のpHになる比率で混ぜる。 3)TrisをやめてHepes-NaOHバッファーに変えて、調製後DEPC処理をする。

RNA実験用のTris-HClのpH調整はどうやればいいですか？ 削除/引用 No.333-21 - 2012/02/01 (水) 15:37:44 - ISHI-ga 樹木組織細胞からRNAを抽出し、逆転写PCRを行うつもりなのですが、 その過程でpHが7.5のRNAsefreeのTrisHClが必要です。 Trisbaseを超純水に溶かし、6NHClにてpH調整を行おうと思うのですが、 pHメーターを用いる場合、電極部と試薬が接触してコンタミをおこす可能性があるので出来れば避けたいです。 かといってpH試験紙では小数点以下の細かい測定はできません。 RNAsefreeの状態を維持しつつ、pH調整を行うにはどのようにすればよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.333-20 - 2011/04/26 (火) 11:19:05 - おお TSさんを攻めるつもりはなかったのですが、言葉って難しいですね。私も質問の仕方によっては問題ないと答えてたと思いますし。。。

(無題) 削除/引用 No.333-19 - 2011/04/26 (火) 10:42:34 - ~ >[Re:17] TSさんは書きました : >ラボで使用しているｐHメーターは温度補正機能が付いているものが多い 今のpHメーターは、温度補償機能がついているのものがほとんどかと思います。 ただ、それは温度による起電力の変化の補正であって、今回のようなpHにより解離定数が変わるものに対応する機能とは別の話です。 試薬（と濃度）ごとの温度係数がプリセットされているのはよほどの高級グレードではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.333-18 - 2011/04/26 (火) 10:26:06 - ~ 温度を測定していたとは驚きです。 >どれぐらいｐHはずれるんですかね？ http://www7a.biglobe.ne.jp/~tatsuya/image/goodsbuffer/buffer_tris.pdf だと、1MのTris/HClがそのくらいの温度で3度上がると、pHが0.08位下がっています。 測定結果と大体合っているのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.333-17 - 2011/04/26 (火) 10:25:56 - TS 私のコメントに触れてくれたみなさま： ありがとうございます。「問題ないと思う」とか少し無責任な言い方をしていたことは反省致します。 温度の話が出ているのですが、ラボで使用しているｐHメーターは温度補正機能が付いているものが多いと思うのですが。（もちろんないのもあるけど、一定以上のグレードであれば付いている） トピ主さんのところはどうなんでしょう？　温度を気にするところかどうか、という判断材料ですが。

(無題) 削除/引用 No.333-16 - 2011/04/26 (火) 09:42:18 - おお http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/general_data/tris_buffer.asp トリスは温度変動がおおきいです。でもほかのバッファーについてはあまり詳しく分かりません。

(無題) 削除/引用 No.333-15 - 2011/04/26 (火) 09:20:02 - 大学院生 おおさん 確かにｐH試験紙ではそこまで細かく見えないですね。 でも、大きくずれてなければ良いと言われたので言われたので 今回はよしとしました。 ちなみに、最初のHCLを入れる前の溶液の温度が27．3℃で 最終的なpHをはかったのが30℃だったのですが、 どれぐらいｐHはずれるんですかね？ 上の人は、タンパク精製以外の実験(主に使うのがwestern,TNE buffer)なら それぐらいの誤差は気にしないと言っていたのですが 今後、使う試薬のpHを合わせるときの参考にしたいのですがどうなのでしょうか。 経験則で構いませんのでよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.333-14 - 2011/04/26 (火) 01:13:11 - おお >[Re:13] 大学院生さんは書きました : > また、ｐH試験紙でチェックしたところ目立ったずれはなかったので > 心配はないかなと思います。 > > ｐH試験紙ではpH8.75と8.8の差は見れないでしょう。。。何が問題だったんでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.333-13 - 2011/04/25 (月) 23:50:37 - 大学院生 みなさん回答ありがとうございます 今日、上の方と話してきました。 Tris-HCLはタンパク実験に用いること もし異常があれば、すぐに作り直すこと とのことでした。 ほかの方にも聞きましたが、あまり厳密にｐHを気にして作っていないそうです 。しかし、タンパク精製などに用いるときには厳密に温度、ｐHに気を付けているといってましたが。 また、ｐH試験紙でチェックしたところ目立ったずれはなかったので 心配はないかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.333-12 - 2011/04/25 (月) 20:36:13 - おお >[Re:11] ~さんは書きました : > 私が唯一そこまで気にする実験をしたことがあるのは、Chen-Okayama法（燐酸カルシウムを用いた遺伝子導入法）です。 > pHの0.02の違いで遺伝子導入頻度が変わったりします。pHメーターの測定値の再現性がそこまで期待できないので、いろいろなpHの液を作り、いいpHのものを選んで使っていました。 pHの微妙な違いで大きく結果が変わりそうなのは私も同じ様にしていました。

(無題) 削除/引用 No.333-11 - 2011/04/25 (月) 16:50:37 - ~ pHメーターの精度よりも、（おそらくコントロールしていない）液温の方がより影響が大きいと思いますが。 液温にして2〜3度くらいの違いでですよね。それ以上の水温の違いはあり得るでしょう。 今回問題があるとすれば、共通試薬について、作製プロトコルにpHの許容範囲が定められていなかった点でしょう。 おそらくpHは調製せず、規定量の試薬を入れて調節しているのでしょうから、それで小数点以下2桁まで合うようなプロトコルは作れないと思います。 そのため、pH8.8が8.75以上8.85未満を意味する表記なのか、8.80ちょうど（本当はその下に0が無限に続く）を意味するのか、他の範囲なのかは、プロトコルに記載しておく必要があるでしょう。 >[Re:8] TSさんは書きました : > 私のあらゆる実験でｐＨの小数点第２桁を気にすることはほとんどありません。 私が唯一そこまで気にする実験をしたことがあるのは、Chen-Okayama法（燐酸カルシウムを用いた遺伝子導入法）です。 pHの0.02の違いで遺伝子導入頻度が変わったりします。pHメーターの測定値の再現性がそこまで期待できないので、いろいろなpHの液を作り、いいpHのものを選んで使っていました。

(無題) 削除/引用 No.333-10 - 2011/04/25 (月) 15:04:18 - おお >[Re:8] TSさんは書きました : > 個人的には、結論から言えば問題ないと思います。 > > 私はｐＨメーターにそこまでの精度を期待していないことが多いですし、 > 実際、もう一回測定したら、最後の桁はズレていると思います。 > > ｐＨ測定（調整）をしている真っ最中でもｐＨ表示は0.01〜0.02くらいは振れているのではないでしょうか。 > > 実験にもよるとは思いますので、あまり乱暴なことは言いにくいですが、 > 私のあらゆる実験でｐＨの小数点第２桁を気にすることはほとんどありません。 > 四捨五入的な感覚で調整しています。 pHメーターはピン切りですが、まあ実験室で使われそうなものは+/-0.01で再現性があるようです。加えてスタンダードの誤差も+/-0.01とか0.02、それと温度の変動もあるので最後のケタはあまり信用できませんね。 なので四捨五入的な感覚な私もあります。pH試験しで大体のpHを合わせるというバッファーの作り方もある種実験ではOKという人もいます。 なのでTSさんのコメントにはかねがね同意なんですが、大丈夫というのは無責任なきがしていましたのであえて前述のような書き方をさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.333-8 - 2011/04/25 (月) 11:55:34 - TS 個人的には、結論から言えば問題ないと思います。 私はｐＨメーターにそこまでの精度を期待していないことが多いですし、 実際、もう一回測定したら、最後の桁はズレていると思います。 ｐＨ測定（調整）をしている真っ最中でもｐＨ表示は0.01〜0.02くらいは振れているのではないでしょうか。 実験にもよるとは思いますので、あまり乱暴なことは言いにくいですが、 私のあらゆる実験でｐＨの小数点第２桁を気にすることはほとんどありません。 四捨五入的な感覚で調整しています。

(無題) 削除/引用 No.333-7 - 2011/04/25 (月) 07:52:40 - nana そもそもpHがどれくらい正確に測れているかも問題ですよね。 すでにみなさんが説明されているように、温度なども影響しますし pHメータの校正も重要です。 pHメータに小数点以下2桁まで表示されるからといって その数字が正しいことが保証されているわけではありません。

雑学ですが 削除/引用 No.333-6 - 2011/04/25 (月) 02:08:02 - Boston-Pullman 無細胞系の転写後修飾のアッセイをしたことがあります。試薬をつくるときの決まりごとは、２５度でｐH７．５でした。HCｌを加えれば、発熱してｐHは低めにでます（水素イオンが活動的になって、検出器にあたる確率が高くなるからですー見かけ上、水素イオン濃度が高い状態となります）。 要は、お手持ちの試薬は、室温が低くなれば、あなたの望むｐHになってくれます。逆にｐH8.8ピッタリの試薬をつくっても、節電が求められる今年の夏はｐH８．７５くらいになります。

(無題) 削除/引用 No.333-5 - 2011/04/24 (日) 14:38:54 - おお >pHの誤差はどこまでが許容範囲なのでしょうか？ それ自身ラボの実験のないよう、ここの実験の内容でちがうでしょうから使う人全体の意見を聞きなさいと申し上げています。もちろん科学的でなく気持ち的にダメという人もいるでしょうけど、黙っていてあとでだましたとかいい加減だとか変なしこりを作るのも不利ではないですか。 ちなみにSDSPAGEに使うTRIS-HCl pH8.8なら個人的にはpH8.75でも私はつかいます。でもまいグレーションスピードの再現性がどの程度なのかときかれると、こたえられません。 滅菌や希釈でpHは変化しますが、滅菌などする前のpHを基準にして、滅菌後のpHは同じ滅菌操作で再現性が取れているはずだと考えて実験することもあります。だから滅菌後のpHのズレはずれていい範囲と思うのはちょっと違うケースも多々あるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.333-4 - 2011/04/24 (日) 14:11:17 - validation pHの0.05の差が許容できるか出来ないかを確認するためにはどういった 作業が必要と考えられるか、考えてリストアップしてみなさい。 「妥当性確認」といわれる工学の基本作業で、学生に必要な訓練です。 もちろん、用途によっても違うだろうし、場合分けの切り口はいろいろあるで しょう。

(無題) 削除/引用 No.333-3 - 2011/04/24 (日) 13:25:33 - 大学院生 早い回答ありがとうございます。 明日、上の人に確認してみます。 追加で質問なんですが pHの誤差はどこまでが許容範囲なのでしょうか？ オートクレーブやメスアップでｐHがずれると聞いたのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.333-2 - 2011/04/24 (日) 12:52:07 - おお それはラボのその溶液を使う可能せいがある人と話をした方がいいと思います。ラボや個人で違う判断基準があるかもしれませんので、ここでいいよといわれてもラボで使っているひとが文句いうかもしれません。だいたい何に使うか想像できますし、その場合はほとんど違いを認識できないだろうとおもいますが、それも実験で変わってくる可能性もありますし。 もし1L作ってあるんであれば12.1グラム加えてpHを合わせ直して1100mlにフィルアップするという手もあります。

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