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(無題) 削除/引用 No.332-2 - 2011/04/24 (日) 04:21:15 - おお >問題なくウェスタンの結果が得られた頃との違いはlysisの条件なので、 >この条件がバンドの乱れの原因だと考えています。 後学のために問題のなかった時のバッファーや条件を教えていただけませんか。あとその比較から原因を考察できるかもしれませんね。 ライセイとはクルードであるということでやはり理想的から外れています。ただあまり細かく分析したことがないので何が原因と一概に言いにくいです。塩濃度は低い方がいいのですが、高い場合ははバンドがぼやけてきます。 ソにケーションをしているのでDNAが分断されて交じっているかもしれません。それも原因の一つになるかもしれません。DNAで気がついたのですが、タンパク抽出用(といいますか細胞破砕用)ガラスビーズを加えるとそれに吸着されやすいです。 邪魔なものがあるという観点で工夫できることはのせる量が少なくてもいいなら1xSDSサンプルバッファーで薄めるなども効果があるかもしれません。 その他手のこんだ方法論はあるにはあります。1xSDSサンプルバッファーで透析とか、TCAやアセトンで沈殿させて脂質などの成分を除去など。。。でも ステップがふえるのもそれなりにフィルターを通すことにもなります。 沈殿させてというのはアイデアとしていいとは思いますがプラクティカルに再溶解しにくくなるという相談がここにもいろいろと寄せられています。

lysis bufferによるウェスタンへの影響 削除/引用 No.332-1 - 2011/04/23 (土) 23:33:20 - 黒夢 いつも参考にさせていただいています。 HEK293Tをlysisし、15krpm、4℃、10minで得た上清をウェスタンしているのですがどうもバンドに乱れが生じてしまいます。（バンドというよりドット、通常のレーン幅よりだいぶ細く検出がみられるetc） 問題なくウェスタンの結果が得られた頃との違いはlysisの条件なので、この条件がバンドの乱れの原因だと考えています。 lysis条件は以下になります。 buffer組成 Tris-HCl pH8.0 100mM NaCl 150mM EDTA 1mM NP40 1% SDS 0.1% DTT 1mM PIC 1× Lysis sonication 5s×8回 on ice 10min 15krpm 4℃ 10min 基礎的な内容で大変申し訳ないのですが、トラブルの原因をご存知の方、似たような経験をお持ちの方がいらっしゃれば、ご教授お願いします。

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