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Re: トランスジェニックマウスについて 削除/引用 No.33-3 - 2011/02/18 (金) 17:16:33 - TG > まずは細胞で試してみたら良いと思いますが、pBigTに入っているRosa26 locusの配列にはプロモーター活性がないのではないでしょうか。 やっぱりそうだったのですね。それで、2 stepでしかもROSA26 locusにknock-inしないといけないのですね。 > Creマウスとそれぞれ掛け合わせて、きちんと発現が見られるかを検討する手間を考えるとノックインの方が、早く確実にできると思います。 急がば回れ、ですね。サザンの方法も確立されているみたいですし、ROSA26領域に組み込むことを第一に考えていきたいと思います。 JHさん、アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.33-2 - 2011/02/18 (金) 09:58:38 - JH まずは細胞で試してみたら良いと思いますが、pBigTに入っているRosa26 locusの配列にはプロモーター活性がないのではないでしょうか。 代案としてはCMVやCAGのプロモーターを使うことも考えられますが、そもそもトランスジェニックの場合には、ラインによって臓器および細胞レベルでの発現にばらつきが出ますので、自分の目的に沿ったラインの選別という作業が入ります。Creマウスとそれぞれ掛け合わせて、きちんと発現が見られるかを検討する手間を考えるとノックインの方が、早く確実にできると思います。 組織特異的なプロモーターの下流に直接繋げるか、コンディショナルにするかは、CreERなどの発現誘導システムを使わない限り、それほど変わらないと思います。

トランスジェニックマウスについて 削除/引用 No.33-1 - 2011/02/18 (金) 05:05:07 - TG トランスジェニックマウスについての質問です。遺伝子Aのノックアウトマウスを作製したのですが、ほとんどphenotypeがありません。ところが、この遺伝子AのtransgeneをトランスフェクションでHEK293に導入すると、細胞がarrestになります。そこで今回、遺伝子AのcDNAの前にloxP-stop-loxPを組み込んだtgマウスを作製し、組織特異的なCreマウスと交配させて、組織特異的に遺伝子Aを強制発現させようと思っています。例えばpBigT vectorを用いて、ROSA26 promoter-loxP-stop-loxP-遺伝子AのcDNAという順番でconstructを作製し、そのままトランスジェニックマウスを作った場合、組織特異的なCreマウスと交配させたときにうまくCreが働かない(うまくstopがloxPではずれない)とかあるのでしょうか？ROSA26 promoterを使う場合、vector作製を2 stepで行い、ノックインマウスを作製している場合が多いのには何か理由があるのでしょうか？できれば、ノックインではなくトランスジェニックマウスを作製して時間を節約したいのですが、どのように考えればよいのでしょうか？loxP-stop-loxPを遺伝子Aの前にはさむことができるなら、ROSA26にはこだわりません。上記の方法でのトランスジェニックマウスがあまりよくないなら、組織特異的なpromoterに遺伝子AのcDNAを直接つなげてinjectionしようと思っていますが、細胞がarrestになることを考えると少し恐いと考えております。ご意見やアドバイスなどをお待ちしています。

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