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(無題) 削除/引用 No.324-6 - 2011/04/23 (土) 14:18:49 - 310 AP様 ご説明ありがとうございました。理解できました。アダプターの長さが60ｂｐもあるため、オリゴの精製もHPLCやPAGEを2回かけないと問題があるようです。今回の実験では他にも試薬を購入するため、コストの面からアダプター配列のカスタマイズは後回しにして、プロトコール通りと、Taqで処理するのを予備実験で試そうと思います。MERMaid（GENECLEANの低分子用キット）が50bpをどの程度精製し回収できるかが分からないですが、他は通常プロトコールで行えるので、なんとかなるかもしれません。 他の実験もあるので、遅くなるかもしれませんが、結果が出たらご報告します。

(無題) 削除/引用 No.324-5 - 2011/04/23 (土) 08:51:02 - AP 重合した分が排除されることで、有効なインサートが減って損するのではないかと危惧しました。 先に書いた方法は、ゲノムライブラリーを作るときなどに使われてきた方法です。Klenowで3'陥没末端を埋めて平滑化する要領で、加えるdNTPを制限することで、突出を一部残します。 たとえば、 NNN NNNAT-5' を NNNT NNNAT-5' とするように。 ふつう制限酵素消化末端は相補になるので（例ではAT-5'に対して5'-TA）、ligationによって重合起こりますが、こうすることで防ぐことができます（T-5'に対して5'-Tで対合しない）。それに相補の突出（A-5'）を持つベクターを用いれば、ベクター同士のligationも起こらず、ベクターとインサートが1:1でligationするというのが原理です。 しかし本当にGTあるいはTGの突出末端なら対合しないのでその心配はないわけですが（制限酵素消化で対合しない末端しか生じない状況は思いつかないですが）。 以上、長々書きましたが、TaqとdNTPsで5'突出末端を処理すれば陥没を埋めた上、一塩基のA-3'突出ができますから、もっと簡単に目的を達することができますね。Taqを使ったPCR産物ではligationによる重合や、blunt-end ligationはほとんど起こらないのに、T-ベクターには良く入りますから、効率はかなり高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.324-4 - 2011/04/23 (土) 02:33:52 - 310 AP様、中年様ありがとうございます。 中年様 70％程度と言う数字をどこかで見たことがあります。予備実験で自分の条件下での回収率を求めようと思っています。 AP様 インサート重複は、最近行った制限酵素末端ライゲーションでのクローニングでも見ました。おっしゃるとおりだと思います。 プロトコールではアダプターライゲーション後にゲル抽出のステップがありますので、ここで150bp（アダプター＋インサート）を切り出します。インサートが3つ繋がっても、アダプター1つにインサート2つでも150bpになりますが、そのような産物は、アダプター付加後のPCRで増幅されないため、影響は少ないと考えております。 >突出した２塩基が異なるもので5'突出ならば（たとえばTA-5'）、突出末端内>側に相補なヌクレオチド（dATP)のみを加えてKlenowを効かせると、partial->fillingが起きて一塩基の突出（A-5'）の突出になります。 5'突出末端でGTとTGになっています。dATPとdTTPとklenowをいれると+A付加が起きると言うことでしょうか？私はTAクローニング用に平滑末端に+AをつけるのにTaqを使っており(INVITROGENのTA-cloning kitのプロトコールを参考にしています。）、今回の件でもTaqとdATPとdTTPで+A付加が起きるのではと思ってはいますが、効率がどのくらいか分からず、illuminaのプロトコールでも+A突出にTaqではなくTerminal Deoxymucleotide Transferase(TdT)を使っているので、踏み切れません。できるだけ予備実験で行ってみようとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.324-3 - 2011/04/22 (金) 23:44:58 - AP その実験手技はよくわからないのですが、 TAクローニングだと、インサート同士の重合や、ベクター同士のligationが起こらないですが、制限酵素消化の突出末端でligationしようとすると、それが高頻度で起こって困ったことになるのではないでしょうか。 突出した２塩基が異なるもので5'突出ならば（たとえばTA-5'）、突出末端内側に相補なヌクレオチド（dATP)のみを加えてKlenowを効かせると、partial-fillingが起きて一塩基の突出（A-5'）の突出になります。これに対して、相補の一塩基突出となるベクター（T-5'）を用いると、インサートの重合、ベクター同士のligationを防ぐことができます。

(無題) 削除/引用 No.324-2 - 2011/04/22 (金) 21:46:48 - 中年 横レスかもしれませんが、PAGEからの回収率は低いとは言っても半分にはなりませんよ。

Oligonucleotide for Adaptor ligation 削除/引用 No.324-1 - 2011/04/22 (金) 10:54:04 - 310 illuminaのparallel DNA sequencerで制限酵素消化された50bpの超多型配列の解析を行うことになりました。 illuminaのキットの説明書では、100bp以上用のDNA精製キットとアガロースゲルを使ってライブラリの作成を行っています。私たちの目的配列は50bpの超可変配列です。アクリルアミドゲル泳動による分離精製を代わりにに行おうと思っていますが、ゲルを融解させるアガロースに比べサンプルの回収率が低いのではと心配しております。 精製の回数を減らすため、通常のプロトコールのライゲーション前に行われる末端平滑化とTdTによるA付加を避けられないか考えています。 私たちの断片には左右に制限酵素で処理された2bpの5’突出末端を持ちます。これに直接アダプターをライゲーションできるかをilluminaに相談しました。illuminaからアダプター配列をいただき、2塩基の付加により私たちのDNAとライゲーションが可能でありそうなこともわかりましたが、アダプターオリゴの精製については答えられないそうなので、自分で想像しなければなりません。 ライゲーションは相補鎖の関係にあるsingle strandのオリゴ2つ(61mer&59mer)と、ライゲーション試薬、目的のDNA断片を混合し30度10分で行います。この場合、皆様のお考えではHPLCとPAGE精製のどちらがよろしいでしょうか？オリゴ作成会社は今までプライマーを作ってもらっているオペロンにしようと思っていますが、長いのを作るのは初めてなので、少し心配です。おすすめの会社など紹介していただければ幸いです。 長文失礼致しました。よろしくお願いいたします。

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