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回答ありがとうございます。 削除/引用 No.323-9 - 2011/04/22 (金) 22:36:39 - AI 質問した者です。 多くの回答ありがとうございました。 インサートを増やしたものと全く同じプライマーを使った事がそもそもよくなかったみたいですね。それに加えて、インサートのサイズも小さいのでfalse positiveの可能性が大きくなったみたいです。 皆様のご指摘どおり、ベクター上のプライマーかあるいはベクターとインサート内のプライマーでチェックしてみようと思います。 すごく勉強になりました。 それと、サーバーについて、私も４０４がでて困っていました。 でも見られる方法があるんですね。 役に立つ回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.323-8 - 2011/04/22 (金) 12:06:24 - AP >トピズレですが、サーバーについてですが、 情報ありがとうございます。過去の板はどこに行ってしまったかと思いましたが、何のことはない「一つ前のフォーラム」のリンクから、さらに過去にさかのぼれるようですね。 ブックマークやGoogle検索からアクセスしようとすると404であせってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.323-7 - 2011/04/22 (金) 11:12:06 - 310 私は、ベクターのプライマーを使うことに加え、ヒートショック後の1時間培養後に遠心し培地で洗った菌をプレートにまいています。この場合何も無いところを引っかいても、シグナルは弱いか全く無いかくらいしか出ません。 しかし、配列情報の無いベクターをもらってクローニングした際は、インサートのプライマーを使わざるを得ず、コロニーPCRポシティブを選んで（殆どあたりで、しかもコロニーの無いプレートのを引っかいた2つのPCRはネガティブ）、ミニプレップを行ったところ、ことごとくセルフライゲーションがメインでわずかにインサート込みのクローンがコンタミしているという、いままで見たこともない結果になりました。たしかに単クローンのように見えていたのにと首をひねりながら、原因究明のためベクター配列をもらってオリゴを注文しているところです。 インサートのプライマーをコロニーPCRに使うと何が起きているか分からなくなる悪例です。ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.323-6 - 2011/04/22 (金) 10:51:34 - thx >過去トピにもたびたび出ていた話題ですが、いつも間にかサーバーが更新されていて、旧サーバーの情報はアクセスも検索もできなくなってしまったようです。 貴重なKnowledge baseでありえたのに残念 本当にこのフォーラムにはお世話になっています。 トピズレですが、サーバーについてですが、 www.kenkyuu.net から www.kenkyuu2.net に、一部の機能をサーバー移行しているみたいです。 Googleキャッシュが反映されていないページへは、 2 を、該当箇所に加えると、たどり着けるみたいです。

(無題) 削除/引用 No.323-5 - 2011/04/22 (金) 08:04:37 - AP >その後、PCR産物を増やしたのと同じプライマーでコロニーPCRを行うと、すべてのコロニーから目的の大きさのバンドが得られたため、 大腸菌液にはligation反応液が含まれますので、ligationの原料・産物であるDNAもプレートに塗りたくられています。お書きになったやり方では、プレート上のどこを突いても（コロニーの無いところでも）PCRがかかることでしょう。 クローニングサイトをはさむベクター配列のプライマーとか、インサート内とベクター間で増幅させるプライマーで、正しくligationされたコンストラクトのみ増幅が起こるか、それが区別きるようなデザインにすべきです。 過去トピにもたびたび出ていた話題ですが、いつも間にかサーバーが更新されていて、旧サーバーの情報はアクセスも検索もできなくなってしまったようです。 貴重なKnowledge baseでありえたのに残念

(無題) 削除/引用 No.323-4 - 2011/04/22 (金) 02:32:24 - おお 精製後のプラスミドでテンプレートが多すぎるためにかかりにくいということもあります。とくにマイクログラム単位でつかうと。 バンドが本物かどうかうたがうことも考えないといけないわけですが、よわいなりにもバンドが得られるなら、そのクローンをほかの方法で確認して見るのも手だと思います。 そもそも精製後にPCRで確認するのはコロニーPCRのスクリーニングの時以上の情報があまり得られないので意義が弱いですよね。

(無題) 削除/引用 No.323-3 - 2011/04/22 (金) 01:50:25 - ab > PCR産物を増やしたのと同じプライマーでコロニーPCRを行う よくありがちですが、これが原因です。

(無題) 削除/引用 No.323-2 - 2011/04/22 (金) 00:48:37 - Boston-Pullman 150bpとサイズが小さいのが気になります。抽出後もしくはコロニーPCRのPCR産物は本物でしょうか？プライマーダイマーはよく知られた現象なので。 PCRに使うプライマーの片方をベクター側に設計して、コロニーPCRでの確認するのが良いと思います。

コロニーPCRとプラスミド抽出後のPCR 削除/引用 No.323-1 - 2011/04/22 (金) 00:36:34 - AI クローニング後のインサートのチェックの件で質問させていただきます。 150bpほどのPCR産物をクローニングし大腸菌の形質転換を行いました。 その後、PCR産物を増やしたのと同じプライマーでコロニーPCRを行うと、すべてのコロニーから目的の大きさのバンドが得られたため、 液体培養にてプラスミドを抽出しました。 その抽出したプラスミドを使って、同じプライマーでPCRをおこなったのですが、増えない、あるいは増えてもすごく少量のPCR産物しか得られません。 抽出にはキットをつかっており、キットそのものには問題があるとは思いません。 液体培養をしても、プラスミドがうまく増えてないのかと思うのですが、どなたか原因、解決方法を知ってらっしゃる方はおられるでしょうか？ よろしくお願いします。

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