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(無題) 削除/引用 No.319-9 - 2011/04/25 (月) 03:19:04 - おお >[Re:8] あさんは書きました : > 水に不溶性の膜タンパク質を、可溶化して共沈殿というのは変な理屈ですよね。 > 水に溶けないんだから、くっついちゃうんじゃない？といつも思います。。。 膜タンパクはあまりやらないのでなんともいえませんが何となくそんな感覚は分かるような気がします。可溶性タンパクも相互作用が疎水結合を利用してたりしますし、、、そういう意味ではまあどっちもどっちかと。。。 大昔にやっていたのは膜にあるコンプレックスをクロマトで単りしていました量があればわかり易い方法かと。 > > 私もTritonX100->NP40->CHAPSの順に試します。0.1%か1%でですが、でタージェンとの濃度は、脂質に対する量が大切で、濃度はあまり関係ないと思っていますが、どうでしょうか。 私もそう思います。ただ限界みせる濃度を超えることも一つの指標です。

(無題) 削除/引用 No.319-8 - 2011/04/24 (日) 20:10:08 - あ 水に不溶性の膜タンパク質を、可溶化して共沈殿というのは変な理屈ですよね。 水に溶けないんだから、くっついちゃうんじゃない？といつも思います。。。 私もTritonX100->NP40->CHAPSの順に試します。0.1%か1%でですが、でタージェンとの濃度は、脂質に対する量が大切で、濃度はあまり関係ないと思っていますが、どうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.319-7 - 2011/04/24 (日) 04:53:16 - おお TRITONーx100、NPー40、CHAPSは濃度にもよりますがHLBから、膜を十分溶解する能力があるのではないかと思われているようです。でも膜フラグメントをIPしているかどうかは実際結論がだせるかというとわかりません。ただ同様のバッファーで洗うことでまく成分も溶解が進むとはおもいます。 にた問題でみせるを形成したでタージェンとにたまたま共存しているだけで結合してないタンパクをIPしてないかという心配をよく持ちます。いろいろ質問するのですがどなたもまんぞくした回答をおもちではないようです。強いていうと、膜フラグメントにせよ、みせるにせよネガコンの膜タンパクがあれば解決するような気がします。

(無題) 削除/引用 No.319-6 - 2011/04/24 (日) 04:40:39 - おお でタージェンととタンパクへの影響は個々で調べないと分からないです。TRITONXー100では活性に必要なコンプレックスが維持できない膜タンパクもあり、deoxcholateでうまく行ったとか、逆のパターンもあります。 deoxcholateはCDK/CYCLIN/CDKいんひビターのコンプレックスからCDKいんひビターをはがしてしまい細胞ないのコンプレックスを反映していないというれいもあります。 サイトゾルに存在するタンパクは第１選択としてTRITONXー100/NPー40を使うのがポピュラーです。逆にいつもこれで良いのかという疑問は持っていていいかと思います。 IPのときの抗体も個々で相性があるようです。

(無題) 削除/引用 No.319-5 - 2011/04/23 (土) 18:05:19 - あ 横からすみません。 TRITONーx100、NPー40、CHAPSは、どう使い分けてますか？ どれもよく使われるデタージェントだと思いますが、強さ（変成させてしまう、相互作用を壊してしまう、膜の可溶化が十分に行く行かないなど）をどう考えていますか？ どれも大差はなく、全部試してうまく行ったデタージェントでさらに実験、という感じでしょうか。 膜タンパクだと、膜の可溶化が不十分だと、膜ごとIPされてしまって、相互作用しているのか膜を単離しているのか判断が難しいと思うのですが。

有難う御座いました 削除/引用 No.319-4 - 2011/04/21 (木) 18:39:13 - hwithe >>おお様 大変詳細に御教示頂きまして誠に有難う御座いました。 私自身の実験としてはWestern Blotだけの予定ですので、RIPAで全く問題なさそうですね。 RIPAならlaboにありましたので、お蔭様で買わずにすみそうです。 御教示頂いた方法で来週にでも早速抽出してみます。 有難う御座いました。

有難う御座いました 削除/引用 No.319-3 - 2011/04/21 (木) 18:30:14 - hwithe >>おお様

(無題) 削除/引用 No.319-2 - 2011/04/21 (木) 13:43:34 - おお >[Re:1] hwitheさんは書きました : > 現在、A549細胞を用いたin vitroでの実験で、膜タンパク質(トランスポーターなど)のWestern Blotを行うため、蛋白抽出を検討しております。 > > SDS-PAGEにかける際に、蛋白抽出の際のRIPA buffer(プロテアーゼ阻害剤を含む)でSDSを含有しているとタンパクの変性を来たすため使用する抗体によってはSDSを含まないRIPA bufferで蛋白抽出を行う必要があるとありました。一方で、膜タンパク質の抽出においてはSDSを含有していないとうまく抽出できないと記載されているものもありました。 まず目的を確認させてください。IPをするとか、活性をはかるとかありますか? それとも抽出してウエスタンだけでしょうか? 抽出してウエスタンだけならSDSのはいったRIPAでかまいません。サンプルバッファー直接でも出来ない事はないです。ディシュについている細胞をPBSなどであらい、直接RIPAをディシュにかけて細胞を溶解してスクレイパーとかつかってチューブに回収して、10000gくらいの遠心を10分いじょうやって上澄みをとればいいです。 膜タンパクの抽出ならRIPAでなくとも、TRITONーx100、NPー40、CHAPS、デオキシコール酸などの界面活性剤で一種類単独でもたいてい抽出できます。ラフとを構成してたりしてるばあいは若干工夫が必要かもしれませんが、そこまで見る実験はまれです。 またしめした界面活性剤が必ずしもターゲットのたんぱく質をへんせいさせないとは限りません。 また考えているトランスポーターなどのたんぱく質そのものやホモログで同じような実験がされてないか調査すると絶対ではないですが筋道が立てやすいのでは。 キットはどんなものを考えているのか分かりませんが、膜タンパクだけを濃縮できるものはTRITON X114で可溶化して、40度ぐらいに温度をあげるとTRITON X114が疎水性タンパクを巻き込んで水相から分離するのを利用してますTRITON X114で文献検索するとすぐ見つかると思います。

膜タンパクの抽出方法について 削除/引用 No.319-1 - 2011/04/21 (木) 12:49:56 - hwithe いつも参考にさせて頂いています。 基礎的な内容で大変申し訳ないのですが、 周りにも知っている同僚がいないため、質問させて頂きました。 現在、A549細胞を用いたin vitroでの実験で、膜タンパク質(トランスポーターなど)のWestern Blotを行うため、蛋白抽出を検討しております。 SDS-PAGEにかける際に、蛋白抽出の際のRIPA buffer(プロテアーゼ阻害剤を含む)でSDSを含有しているとタンパクの変性を来たすため使用する抗体によってはSDSを含まないRIPA bufferで蛋白抽出を行う必要があるとありました。一方で、膜タンパク質の抽出においてはSDSを含有していないとうまく抽出できないと記載されているものもありました。 そこで質問させて頂きたいのですが、 �@膜タンパク質のWestern Blotを行うためには、RIPA bufferを用いる場合に蛋白抽出はどのように行うべきなのでしょうか？ �Aまた、膜タンパク質自体は細胞全体のタンパク質と比べて非常に少ない事からは、高価ではありますが膜タンパク抽出キットを購入した方が良いのでしょうか？ 基礎的な内容で大変申し訳ないのですが、ご存知の方がいらっしゃれば、ご教授お願いします。

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