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(無題) 削除/引用 No.306-13 - 2011/04/27 (水) 17:52:02 - 素人 いろいろコメント大変勉強になりました。大変助かっております。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.306-12 - 2011/04/22 (金) 19:04:48 - AP >二次抗体をご提案のmouse anti-rat IgGにすることと、goat anti-rat IgGの二次抗体を用いる方、どっちが特異性が高いんでしょうか？ 理屈でいうと前者です。 anti-rat（あるいはほかの動物） IgG抗体といっても、多かれ少なかれ別種のIgと交差反応を起こします。とくにポリクロなら必ず交差反応を起こす抗体が含まれています。お使いのgoat anti-rat IgGはマウス、あるいはさらにヒト、ヒツジやヤギなんかとも交差するかもしれません。 製品には、交差性を抑えるための処理（異種血清に対する前吸収など）の程度が違うものがいろいろあります（製品グレードなどによる）。どのような処理が行われているかや、交差性の程度については、カタログなど、メーカーの情報にあるはずです。 mouse anti-rat IgGは、同種であるマウスのIgGとの交差性が最小のはずですし（自己抗原に対する寛容性により）モノクローナルなので、交差による障害はきわめて起こりにくいと思います（モノクローナル一次抗体にたいして、モノクローナル二次抗体を使う場合、サブクラス特異性に注意してください）。

(無題) 削除/引用 No.306-11 - 2011/04/21 (木) 18:19:03 - 素人 >①1次抗体に直接標識してしまう >②1次抗体を反応させる前に、未標識のgoat anti-mouse IgG antibodyを反応させる 最もご指摘のとおりだと思います。これから直接標識の抗体と、未標識の未標識のgoat anti-mouse IgG antibodyも検討の視野に入れて進めていきたい思います。大変助かります。 >1. 「mouse-on-mouse」というキーワードで検索してみてください。 >2. 一次抗体をRat anti-マウス標的抗原 抗体にして、二次抗体をmouse anti-rat IgGという組み合わせにすれば、二次抗体は同種であるマウスの内在性Igとは反応しないはず mouse-on-mouseで検索してみたら、Abcamのところで改善方法（完全に解決できる保証はできないそうです）がみつかりました。ありがとうございます。しかし、一次抗体をRat anti-マウス標的抗原 抗体にして、二次抗体をご提案のmouse anti-rat IgGにすることと、goat anti-rat IgGの二次抗体を用いる方、どっちが特異性が高いんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.306-10 - 2011/04/20 (水) 20:20:55 - AP 特に相手が骨髄ですから、endogenouse IgやFc receptorにアプライした抗体と反応して生じるバックグラウンドの影響は非常に大きいと思います。 1. 「mouse-on-mouse」というキーワードで検索してみてください。 2. 一次抗体をRat anti-マウス標的抗原 抗体にして、二次抗体をmouse anti-rat IgG（monoclonal antibodyとして販売されているとおもいます）という組み合わせにすれば、二次抗体は同種であるマウスの内在性Igとは反応しないはず。

(無題) 削除/引用 No.306-9 - 2011/04/20 (水) 17:04:52 - ~ >どうじてもこの抗体が必要でしたら 必要なのは2次抗体ではなく、1次抗体（とその検出系）ですよね。 ①1次抗体に直接標識してしまう で2次抗体を用いなければ、2次抗体の特異性は関係なくなります。 ②1次抗体を反応させる前に、未標識のgoat anti-mouse IgG antibodyを反応させる で、1次抗体以外のマウスIgGをブロックすることは出来ると思います。 （どのくらいバックグラウンドが残るかは評価が必要でしょうけれども） 1次抗体と2次抗体を事前に混合するやり方は耳にしますが、具体的なメソッドが分かりません。 多分どなたか答えてくれるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.306-8 - 2011/04/20 (水) 16:22:14 - 素人 ご指摘のとおりだと思います。 昨日、goat anti-mouse IgG antibodyの二次抗体だけで染めてみたら、残念ながらmouse anti-rat IgG antibodyの一次抗体がある時と変わらない結果が出ました。 どうじてもこの抗体が必要でしたら、どういった特殊な操作が必要ですか？

(無題) 削除/引用 No.306-7 - 2011/04/19 (火) 10:31:35 - AP 場面が公式、非公式にかかわらず、意味がよく伝わるように、勝手に略さずに正確に表記するように心がけましょう。 免疫動物　抗/anti抗原　（モノクローナル/ポリクローナル）抗体　のように。 goat anti mouse ではなく、goat anti-mouse IgG antibodyとか。 anti‐mouse IgG抗体なら、マウスの組織中に内在するIgG等と、一次抗体非依存的に反応するでしょう。いわゆるmouse-on-mouseになって、どうしてもこれを使わなければならないときは、特殊な操作が必要になります。 anti-rat IgG抗体でも、マウスに対する交差反応で、一次抗体非依存的な反応があるかもしれません。 なので、どちらかは正しいパターンだとはいうことができません。 たとえば、一次抗体をスキップして、二次抗体のみを反応させたコントロールは見ていますか。 一次抗体をラットモノクローナル抗体にして、二次抗体をマウス抗ラットIgGサブタイプ特異的抗体などにすると内在性Igとの交差が防げるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.306-5 - 2011/04/19 (火) 10:08:30 - よっしー 抗原が手元にあれば，抗原でそれぞれの抗体を吸着後，染めてやると特異的なシグナルのみが消失すると思います． なんとなくAPさんの仰っているように，rat anti-mouse IgG antibodyが内因性IgGを拾ってるような気がしますが・・・ 方法２の方がシグナルが多いのではないでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.306-3 - 2011/04/19 (火) 09:52:17 - 素人 いいえ、マウスの切片に対し、 方法１ 一次抗体　mouse anti-Rat monoclonal antibody（マウス認識可能なもの） 二次抗体　goat anti mouse 方法２ 一次抗体　Rat anti-mouse monoclonal antibody 二次抗体　goat anti rat という二通りのやり方で行ってみましたが、結果が異なって困っています。

(無題) 削除/引用 No.306-2 - 2011/04/18 (月) 12:30:31 - AP >mouse anti-Rat monoclonal antibodyとRat anti-mouse monoclonal antibody 二次抗体（anti-IgG)のことですか？　ならば、一次抗体もRat抗体とmouse抗体を使い分けているということでしょうか。 だとしたら、Rat anti-mouse monoclonal antibodyはmouse標本に内在するIgとも反応してしまいまうとおもいますが。

免疫染色の isotype control 削除/引用 No.306-1 - 2011/04/18 (月) 10:56:40 - 素人 いつも大変勉強にさせていただいております。 免疫染色に関して困ったことが二つあります。 まず、マウスの骨髄凍結切片に対し、mouse anti-Rat monoclonal antibodyとRat anti-mouse monoclonal antibodyで免疫染色行った結果、まったく異なるパターンの発現が見られました。どっちを信じればよろしいでしょか？ また、マウスの骨髄凍結切片に対し、mouse anti-Rat monoclonal antibody を用いて免疫染色を行う場合 isotype control を使うとしたら mouse IgG と Rat IgG　どっちを使用すべきでしょうか？

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