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(無題) 削除/引用 No.299-5 - 2011/04/16 (土) 10:43:38 - 新米院生 おお様 たびたびのアドバイス恐縮です。 なるほど、早速試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.299-4 - 2011/04/16 (土) 09:55:02 - おお 血清のカタラーゼの影響もあるかもしれません。バイチで希釈しているようでしたらPBSで目的の10倍クラいののうどまで希釈して培養しているwellに直接加えるとかした方がいいかもしれません。血清のロットが変わればドラスティクに変化する恐れもあると思います。 H2O2がだんだん抜けているのであれば、回を重ねるほどに細胞障害性が落ちていくはずです。

ありがとうございました。 削除/引用 No.299-3 - 2011/04/16 (土) 09:40:15 - 新米院生 おお様 すばやいアドバイスありがとうございます。 私も過酸化水素の分解は考慮しなければいけないと思っております。あいにく吸光度計が近くにありませんので、使用は最低でも購入してから1ヶ月以内と決めて実験に用いています。 過酸化水素処理した細胞の形態は変成がはっきりしますので、MTTの結果と顕微鏡下での観察はパラレルに動いていると思います。 また細胞の状態ですが、凍結している物を起こしてから20継代くらいまでの間の細胞を使用するようにしており、細胞を播種するときもトリパンブルーでviabilityを確認しています。 過酸化水素の希釈がなんとなく怪しいと思っているのですが、、、。 何かポジコンになるような化学物質をさがして実験してみます。

(無題) 削除/引用 No.299-2 - 2011/04/16 (土) 02:04:06 - おお H2O2の実験だからうまくいってないのかそれともほかに原因があるのかまず見極める必要があります。 H2O2は分解しやすいので私はなるべく毎回濃度をUVの吸収で確認してから使うことにしてます。係数、波長は今思い出せません。 MTTをお使いでしたっけ、、、見た目の死んだ感じといつもパラレルでしょうか? あと細胞の調子が毎回一定でないとすれば、バラつく可能性はありますね。何か安定なケミカルなどの毒性をポジコンで取るとそういうのが分かるかもしれません。 どうしても毎回H2O2の毒性が動くなら、動いた中でも実験がコンシスタントかどうかで結果を判断することもあるかと思いますが、極端に動くならよくないのは確かです。

過酸化水素の細胞傷害について 削除/引用 No.299-1 - 2011/04/16 (土) 00:24:59 - 新米院生 はじめて投稿させて頂きます。 H9C2細胞を用いて過酸化水素による傷害実験の系を組み立てるように教官に言われました。 教官は細胞実験の経験がないので、良いアドバイスが得られていません。 いまのプロトコールは、測定前日に96well plateに細胞を播種し、24時間後に培地を洗浄、 FBS Free培地で調整した過酸化水素を加え、6時間後にMTT試薬で吸光度を測定し、 細胞増殖能を観察して生存率を算出しています。 文献では終濃度400µMでだいたい生存率が6〜7割程度と書かれており、実際うまくいくときには このとおりに行くのですが、系が安定せずに全く細胞が死ななかったり、その逆に2〜3割 の生存率になってしまいます。 いろいろな原因が考えられますが、このような実験を行った経験のある先生で、コツのような物がありましたら、ご教授下さい。よろしくお願いします。

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