BioTechnicalフォーラム [IRS-1のウェスタンブロッティング]

IRS-1のウェスタンブロッティング

No.296-TOPIC - 2011/04/15 (金) 10:04:06 - てつ

ラット骨格筋中のIRS-1(180kDa)の蛋白量変化をウェスタンで検出したいと試みていますが，バンドが検出されません。7.5%のゲル，セミドライ式で転写（すべてBio-radの製品使用），文献で報告がある複数種のIRS-1抗体を使用しています。蛋白の実験は専門ではないのですが，一般的に高分子量のものは難しいようですね。論文等ではIRS-1のバンドが普通に出ているので，何かコツがあるのかもしれないと思っています。どなたか，ラットあるいはマウス骨格筋のIRS-1検出についてご経験のある方，お勧めの抗体や，ウェスタン条件などについてアドバイスを頂けないでしょうか？宜しくお願い致します。
　

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No.296-8 - 2011/04/29 (金) 11:33:30 - てつ

stuさま

やはり皆さん共通にウエットでの転写を実施されているのですね。情報ありがとうございます。連休明けにようやくサンプルが揃いますので，トライしてみます。それでも改善されない場合には，再度投稿させて頂きますので，更なるアドバイスを頂けたら幸いです。

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No.296-7 - 2011/04/25 (月) 17:14:36 - stu

IRSは使用したことありませんが、私も昔高分子量のブロットの不安定さに悩みました。現在は高分子量(150kDa)以上を見る場合、転写は必ずウェットで行います。バッファーは10%メタノールで、24V 1時間行っております。ウェットで行うだけで、かなり違うはずです。
セミドライは高分子量の結果にムラがあり、不向きだと思います。

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No.296-6 - 2011/04/25 (月) 13:15:35 - てつ

proteinさま

具体的条件提示ありがとうございます。メタノールフリーでの転写は実施した事がありませんでした。しかし，それでも結果が不安定という事ですので，この際，タンク式にして不安要素を取り除きたいと思います。ご指摘のあったノンスペについては，リン酸化等の修飾では説明出来ないほど分子量的に合わない位置でした。目的バンドがまったく見えなかったため，1次抗体を1:200程度まで高めたためかもしれないと考えています。
　protein様，あるいはこれまでコメント頂いた方も含めて，用いた抗体のメーカー，商品codeを具体的に教えて頂けると幸いです。

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No.296-5 - 2011/04/23 (土) 03:42:23 - protein

ラット、マウスの筋肉からIRS1を検出したことがあります。
セミドライでも検出できていましたが、
ウェット式に比べて結果が安定しない印象でした。条件が繊細なのかもしれません。
セミドライの場合は転写は2 mA/cm2で30 min
バッファーはメタノール抜きのトリスグリシンでした。

ちなみにノンスペが出ているということですが、
どのようにそう判断されたのでしょうか。
IRS-1は複数のリン酸化サイトを持つせいか、想定分子量とは
違う所にバンドが出る印象がありますし、
細胞種によってもバンドの位置が違った記憶があります。

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No.296-4 - 2011/04/22 (金) 09:05:40 - てつ

GLUT4さま，カイさま

情報ありがとうございます。IRS-1はtotalを検出したいと考えております。セミドライ式でメタノールを20%から5%に下げてみましたが改善しませんでした。転写後のゲルを染めてみると，ご指摘の通り高分子領域は残存率が高い結果でした。ただし，マーカーの高分子バンドはそれなりに転写されています。Westernに用いている抗体はCell Signalingの#2382，santacruzの#sc-559で，いずれもノンスペのバンドのみ観察される状況です。現在，タンク式のブロッターを発注し，同時にsantacruzのIRS-1強制発現細胞のLysateを購入しました。加えて，HepG2, C2C12のLysateを用意して陽性対照とし，実験条件の検討をしてみようと準備中です。引き続きアドバイス宜しくお願い致します。

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No.296-3 - 2011/04/21 (木) 20:53:29 - カイ

解決済みでしたらすみません。

一般的に高分子のものではセミドライはうまくいきづらいと聞きます。
私は高分子（200ｋDaくらい）のものを日常的に扱っているので基本ウェット式でトランスファーしています。
GLUT4様がおっしゃっているように、私もSDSを足したりします。
ただSDSは蛋白を滑りやすくするため、転写膜を通過してしまう（PVDFならニトロセルロースよりましなはずですが）というリスクを抑えるためにメタノールを逆に10％から20％に上げて使用しています。

ウェスタンブロットは奥が深いですし、研究者によってやり方もさまざまです。参考までに。

Re:IRS-1のウェスタンブロッティング

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No.296-2 - 2011/04/17 (日) 21:38:26 - GLUT4

ラット骨格筋でIRS-1のウエスタンをやっています。
IRS-1はphosphoではなくてtotalですよね？
Total IRS-1でしたら、抗体はCellsignalingとMilliporeのいずれも使用したことがあります。

私は7.5％ゲルでウェット式（すべてBiorad製）で転写（100V, 1h）しています。
ブロッキングは5％スキムミルクです。

セミドライ式はやったことがないのでわかりませんが、
高分子のときには転写バッファーにSDS（私は0.04%）を加える、あるいはメタノールを少なくするなどの対策法があると思います。

転写はうまくいっているでしょうか？

IRS-1のウェスタンブロッティング

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No.296-1 - 2011/04/15 (金) 10:04:06 - てつ

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