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(無題) 削除/引用 No.282-7 - 2011/04/20 (水) 16:22:05 - まゆ 皆様、いろいろありがとうございました。 とりあえず、nestedのPCR産物をシークエンスしてみました。 結果、deletion特異的に増幅される配列をきちんと読むことが できました。意外に綺麗な波形でしたので、これで実験をすすめて いこうと思います。 ついでにおたずねしていた、 「A-B-C/delのようなディプロタイプは、 　相同染色体の片方が正常型、もう片方が欠損型」 という理解で良いと思いますが、これに関して別の疑問が沸いて 調べた限りでは氷解しないので、別にトピックを立てたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.282-6 - 2011/04/14 (木) 08:52:38 - ops >正常型では、PCRで増幅されたとしても25kbぐらいのサイズのため、PCRの反応条件を鑑みるとそれらが増幅されることはなく実質的にはアガロースレベルでは検出できません。でも考えてみると、中途半端に伸長したフラグメントなどがシークエンスの際に悪さをする可能性もあるかもしれないとも思います。 量から考えると（Logの反応産物と、Linearの反応産物）まあ微量でしょうが、 アガロースゲル電気泳動をおこなって切り出してから、 その精製物をシークエンスにかけるのが、いいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.282-5 - 2011/04/13 (水) 09:56:20 - まゆ ops様、nana様、返事が遅れてすみません。 >Deletionが大きすぎて、長いPCR産物の方が検出できない実験系なのか、 まさにこれです。正常型では、PCRで増幅されたとしても25kbぐらいのサイズのため、PCRの反応条件を鑑みるとそれらが増幅されることはなく実質的にはアガロースレベルでは検出できません。でも考えてみると、中途半端に伸長したフラグメントなどがシークエンスの際に悪さをする可能性もあるかもしれないとも思います。今、考えているのは、del型で増えてきたPCR産物をさらにnested PCRして特異性を高めれば良いかもと思っています。いずれにせよ、まずはシークエンスをやってみて余裕があれば、nested PCRあるなしで違いがあるのかのデータも見てみたいと思っています。 「A-B-C/delのようなディプロタイプ」が実際どうなっているのかについては、まだ正解が分からないのですが、nanaさんのご指摘のように >染色分体の話ではなく相同染色体の片方が正常型、もう片方が欠損型 という解釈が正しいのかなと思っています。これに関して何かご指摘などいただけたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.282-4 - 2011/04/12 (火) 09:15:02 - nana 相同染色体の片方が正常型、もう片方が欠損型、ということですよね。 染色分体の話ではないと思いますが．．．

(無題) 削除/引用 No.282-3 - 2011/04/12 (火) 08:23:16 - ops >あるプライマーペアは、deletionを起こしている部位をはさむように特異的にある長さで増幅することで、delを検出することが知られています。 という説明から、（特に、「はさむ」という言葉から） 私もあなたの上司と同じように、 Deletionを含まない、長いPCR産物と Deletionを含んでる、短いPCR産物の ２つができる可能性を考えてしまいます。 でもなぜか、 >そのPCR産物はゲル上はシャープな1本のバンドとして検出されます。 との事ですので、 Deletionが大きすぎて、長いPCR産物の方が検出できない実験系なのか、 プライマーが、実はDeletionの部分をはさんでいるのではなくで、 ちょうど、つなぎ目の部分をまたぐように（片方の）プライマーが 設計されている実験系なのでしょうかね。 ちょっと、そのあたりは御自身で確かめていただいて、 上司の方にちゃんと説明されてはいかがでしょうか。 >染色体のうち、一方の染色分体にA-B-Cというハプロタイプがのっていて、もう片方の染色分体はその遺伝子座位が欠損しているというイメージなのですが、 私も思います。

(無題) 削除/引用 No.282-2 - 2011/04/12 (火) 02:22:11 - まゆ すみません。後半部分ですが、このどちらでもなくて、「A-B-C/delのディプロタイプ」とは、相同染色体の片方は、A-B-Cのハプロタイプを持ち(染色分体同士は同じA-B-Cのハプロタイプ)、もう片方がその遺伝子座位が欠失している（２つの染色分体のどちらでも欠失）、というのが正しい理解でしょうか。 　正解があるか分かりませんが、いずれの場合でも、PCRで増えたのは欠失特異的領域なので、そのPCR産物をそのまま精製してシークエンスに持っていく、という部分はこの理解で良いのかなと思いますが、助言など頂けたらと思います。

シークエンスについて 削除/引用 No.282-1 - 2011/04/12 (火) 01:43:12 - まゆ ちょっと混乱しているので教えてください。 ある遺伝子座位は、whole gene deletionがあったりduplicationがあったり します。今、deletionをヘテロで持つ個体(例えばA-B-C/delのようなディプロタイプ)のシークエンスをしようと思っていて、あるプライマーペアは、deletionを起こしている部位をはさむように特異的にある長さで増幅することで、delを検出することが知られています。このdel特異的に増幅されたPCR産物のシークエンスを検討しているのですが、上司に、delのホモではなくてヘテロなのだから、そのPCR産物をシークエンスしても、片側配列が入り込んでぐちゃぐちゃで読めないから、ゲル切りとか検討しないといけないよ、と言われました。私のイメージとしては、delのヘテロであっても、PCRの結果、del特異的な領域を増幅していて、片側のA-B-Cの領域は増幅されていないのだから、ゲルきりなどの操作は不要であると考えていたのですが、間違っていますでしょうか。ちなみに、そのPCR産物はゲル上はシャープな1本のバンドとして検出されます。 　そもそも、私の理解では、A-B-C/delのディプロタイプといった場合、染色体のうち、一方の染色分体にA-B-Cというハプロタイプがのっていて、もう片方の染色分体はその遺伝子座位が欠損しているというイメージなのですが、この解釈自体が間違っているのでしょうか？　もしかして、各染色分体のDNA2重螺旋の片鎖がA-B-Cというハプロタイプで、それの対のDNA鎖が欠損？しているのでしょうか（片方の染色分体も同じ状態）？何だか分からなくなってきました。

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