以前にも投稿させていただきましたが、書き忘れていたことやあれからアドバイスしていただいたことを参考に実験したのですが、また分からないことが出ましたので、今回投稿しました。
酵素遺伝子の塩基配列を解読するために、制限酵素処理してInverse PCRを行い、BglU処理したサンプルは約4000bp、NotT処理したサンプルは約2000bpとそれぞれPCR産物が得られました。精製後、電気泳動で確認し、サイクルシークエンスを行いました。Big Dye Terminater v3.1をプロトコール通りに行い、精製は磁気ビーズを用いるClean SEQとBig Dye X Terminaterの2種類で行いましたが、配列の読み具合に差が出ます。
DNAシーケンサーはABIの3130 Genetic Analyzerです。
精製は、それぞれプロトコール通りに行い、トラブルシューティングなどを参考に色々と変えてみたりもしましたが、改善が見られませんでした。
シーケンサーもそれぞれの精製方法によるランモジュールを使用しています。
NotT処理したサンプルはF・R側とも両方きれいに読めるのですが、BglU処理したサンプルは最初のピークがかなり大きく出て、ガクンとピークが下がり、途中からピークが消えます。単一なバンドが得られているので、混線している感じでもないです。
NotT処理したサンプルの配列は開始コドンが出てくる前にNotTの切断部位が出てきて、環状にした配列の後ろの部分が出てきてしまっているので、開始コドンや活性中心、SD配列を調べるためにもBglU処理したサンプルの配列を読む必要があります。
配列自体はGC rich(70%)で、二次構造を作っているから配列が読めないのかと思いましたが、同じプライマーを使用しているのに、NotT処理したサンプルが読めて、BglU処理したサンプルが読めないというのがよく分かりません。
前回の投稿で、みなさんのアドバイスを参考に何回かやってみましたが、読めませんでした。
PCRでは増幅してもサイクルシークエンス反応ではプライマーがあわないということもあるのでしょうか？？
どうかアドバイスをお願いします。 |
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