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(無題) 削除/引用 No.266-7 - 2011/04/08 (金) 11:11:44 - qwerty >[Re:1] ちえびあんさんは書きました : > 最初のピークが高く出て、いきなり低くなり、途中からピークが消えます。 思い切って鋳型量を減らしてみると改善されるかもしれません。（鋳型のDNAが汚かった（？）ときにそのようなトラブルの経験あり）

(無題) 削除/引用 No.266-6 - 2011/04/08 (金) 10:37:00 - おお ファアード側の読めているところの途中からプライマーを使ってさらに読めばいいのでは?それともフォアードの基部のあたりが読みたいのであれば、私はプライマーを設計しなおします。 あるいはクローニングベクターにいれてベクターから読むか。プライマーか配列自身かどちらが障害になっているかによってもアプローチは変わってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.266-5 - 2011/04/08 (金) 08:14:38 - opq >最初のピークが高く出て、いきなり低くなり、途中からピークが消えます。 そのReverse側のプライマーでサイクルシークエンスを行った時に、 低くなるのがどのあたりかで、原因も変わってくるかと思いますが、 ほぼ最初の方で低くなるのであれば、プライマーのアニーリングが弱く、 サイクルシークエンスが上手くいっていないことが考えられますので、 アニーリングの温度を少し下げてみる事を試してみます。 また、少しは読めて途中でいきなり読めなくなる時は、 非常に強い高次構造を取る部分で、いきなり読めなくなる事も考えられますので、 （例としてはIRES配列やshRNA配列など） その場合、ベタイン（終濃度１Ｍ）を添加することを試してみます。 ただ、高次構造を取る場合でも、すんなりと逆方向からは読めるという事もあります。 Forward側からは読めるのであれば、そちらからどんどんプライマーを設計して、 PCR産物（4000bp）を読み切るということでもいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.266-4 - 2011/04/08 (金) 04:05:35 - 310 他のお二方がプライマー設計に触れられているので、効果が劇的ではないが簡単な方法として、3stepを2stepにする(primerのTmが高めの場合）＋1サイクルごと伸張時間を1秒伸ばす。作業をすべて氷中において行い、冷却遠心などででプレート外側の水気をとばして、直ちに96Cになっているブロックに突っ込む（この際最初の変性時間を30秒ほど長めにする）。 特に最後のやつはTakaraがcold startと呼んでいるPCR特異性増強法なので（変性時間増加は勝手に組み合わせたのですが）、サイクルシーケンスでも悪いことにはならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.266-3 - 2011/04/08 (金) 00:54:03 - 774 一方が読めていて一方が読めないのであれば、ちえびあんさんの方法やテクニック、プライマー以外のreagentsには問題ないはずです。 配列が読めるかどうかは別にして、workすることが確認されているプライマーなのであれば、その読みたい部分が読みにくい構造をとっていたりするのでしょう。途中までちゃんと読めていていきなりシグナルが弱くなって読めない場合などはそうかもしれません。 何度トライしてもあるところから読めなくなるということは稀でしたが経験したことがあります。 自分でデザインしたプライマーで、原因がプライマーなのかなと感じるのであれば、zzzさんの言うように一度デザインし直すのが手っ取り早いのではないかと。

(無題) 削除/引用 No.266-2 - 2011/04/07 (木) 22:38:12 - ｚｚｚ 一番疑わしいのはプライマーダイマーの影響。ＰＣＲ産物をゲル抽精製すると改善することがある。プライマーオリゴの再設計、作りなおしも現実的な選択です。

塩基配列が読めません・・・。 削除/引用 No.266-1 - 2011/04/07 (木) 21:15:03 - ちえびあん 酵素遺伝子の塩基配列を解読するために、Bgl�Uで制限酵素処理してInverse PCRを行い、約4000bpのPCR産物が得られました。精製後、電気泳動で確認し、サイクルシークエンスを行いました。Big Dye Terminater v3.1をプロトコール通りに行い、精製は磁気ビーズを用いるClean SEQとBig Dye X Terminaterの2種類で行いましたが、上手く配列が読めません。 DNAシーケンサーはABIの3130 Genetic Analyzerです。 精製は、それぞれプロトコール通りに行い、トラブルシューティングなどを参考に色々と変えてみたりもしましたが、改善が見られませんでした。 シーケンサーもそれぞれの精製方法によるランモジュールを使用しています。 最初のピークが高く出て、いきなり低くなり、途中からピークが消えます。 Nが出てはいますが、ところどころ読めてはいますので、サイクルシークエンスは上手くいっていると思います。 精製に関しても、Forward側はきれいに読めています。読めないのはReverse側で、論文などの配列を参考にすると、活性中心やSD配列があります。 何か対策やアドバイスをお願い致します。

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