駆け出しの初心者です。
今回、形質転換後の大腸菌からのmidiprepでのプラスミド収量についてご教授いただきたく。
過去の投稿でも類似したものがありましたが、自分の解決策となるものが分からなかったので、改めて質問させて頂きたく思います。
形質転換し、プラスミドを作ってくれる大腸菌を融解してmidi culture後、ロシュのmidiprepキットを用いて行いました。elution後にイソプロ沈し、プラスミドペレットがあるのは確認できています。しかし、濃度と純度測定のために吸光度測定したところ、吸光度比が1.3〜1.5と低く、あがりません。キットの説明によると1.7〜1.8は最低限 期待できるそうですがあがりません。
タンパクが混入している可能性を考慮し、除タンを行い再び測定しましたがそれでもあがらない。
Ampで選択をする場合には長時間培養しすぎるとプラスミドが脱落する可能性もあるという投稿をよみ、ゼオマイシンで選択を行ってみました。それでもあがりません。
目的遺伝子を搭載したもの、MCSをもつもの、パッケージングのプラスミド２種の、計４種類の異なるプラスミドを同時に形質転換、抽出を行ったのですが、不思議な事に１つのプラスミドだけは抽出と精製が一回で上手く行ったのに他の３種についてうまくいきません。すべて同じ条件、同じときにやった実験なので、操作ミスなどは考えにくいと思われます。
何度試してみても上手く行かずに途方に暮れています。ご意見ありましたら寄せて頂きたく存じます。よろしくお願いします。 |
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