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MAPキナーゼのウエスタンにおけるネガコン トピック削除
No.252-TOPIC - 2011/04/05 (火) 14:27:06 - TOKIO
MAPキナーゼのウエスタンを行っている者です。
付着系の培養細胞にある刺激を加えて、その刺激でMAPキナーゼが動いてることを示します。
現在基礎検討として、
培養なし、培養のみ、刺激入れてタイムコース（2時間以内）、で行っているのですが、
刺激なしや培養なしでも、MAPキナーゼのリン酸化タンパクが発現されてしまいます。

当教室のボスに相談して、MAPキナーゼは培地のFCSで動くから、
といってもFCSナシでも動くから、トリプシンも使わない方がよい、などの
アドバイスを受け、FCS2%程度で、付着細胞をPBSで洗ったあとに直接
溶解する方法で行っていますが、
それでも、上記二者がバンドとして見えてしまいます。

よく論文にあるfigureのように、ネガコンでリン酸化がまったく
出ないようにするコツはあるのでしょうか？
ちなみに、ブロッキングにスキムミルクは使っていません。
リン酸化タンパク用に、ということで成書を見て調合したものです。
　
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(無題) 削除/引用
No.252-6 - 2011/04/05 (火) 15:54:09 - Boston-Pullman
バックを下げるのにいくつか思いついたので。MAPKはど素人ですが。

１ 細胞密度を変える。
２ 細胞が接着したら血清無しの培地で半日培養して、刺激の有り無しを比較。
３ インキュベーターから出したら、直ぐに培地を捨て、洗浄なしで氷冷した１０％TCAにてタンパク質を変性させる。

ありがとうございます。 削除/引用
No.252-5 - 2011/04/05 (火) 15:38:58 - TOKIO
ありがとうございます。
刺激して発現がupしていればよいですよね？
「なんでネガコンが出てるの？」とカンファで突っ込まれて
タジタジになってしまったところでした。
もう一度ボスに聞いてみます。

ちなみに、primary細胞なので、
「培養ナシ」は細胞を分離してそのまま溶解したものです。
「培養のみ」は刺激入れずにメディウムのみで培養したもの、
というニュアンスで書きました。わかりにくくて申し訳ありません。

(無題) 削除/引用
No.252-4 - 2011/04/05 (火) 15:00:03 - おお
TSさんのコメントをコピーしたようなコメントをかこうとしていました。

まあ逆に検出限界はいじれますけど。。。オーバーナイトの抗体反応を1ー2時間でやるとか、抗体を薄めに使うとか、、、極端にいじるとまあ作っているという印象が強くなりますけど。。。

(無題) 削除/引用
No.252-3 - 2011/04/05 (火) 14:53:45 - TS
そもそも、無刺激で全くリン酸化が見えないようにする理由、必要はあるのでしょうか？

私もときどきERKなどのリン酸化を見ますが、私の実験では定常状態でもそれなりにリン酸化が見えます。おっしゃられるように、培地に含まれる何かによって刺激が入ってしまっているかもしれませんが、定常状態で多少の活性があるのはそれほど不思議なことでもありません。もちろんEGFなどで刺激を入れれば、リン酸化は大きく増強されます。
刺激、処理による差がきちんとあれば良いというわけにはいかないのですか？

それにWBの場合、露光時間によってバンドの濃さが変わるわけで、参考にされている論文・実験で、本当に無刺激群のリン酸化が全くないのかどうかはわからないと思います。

(無題) 削除/引用
No.252-2 - 2011/04/05 (火) 14:38:24 - 中年
「培養なし」「培養のみ」とは何を指す言葉ですか？

MAPキナーゼのウエスタンにおけるネガコン 削除/引用
No.252-1 - 2011/04/05 (火) 14:27:06 - TOKIO
MAPキナーゼのウエスタンを行っている者です。
付着系の培養細胞にある刺激を加えて、その刺激でMAPキナーゼが動いてることを示します。
現在基礎検討として、
培養なし、培養のみ、刺激入れてタイムコース（2時間以内）、で行っているのですが、
刺激なしや培養なしでも、MAPキナーゼのリン酸化タンパクが発現されてしまいます。

当教室のボスに相談して、MAPキナーゼは培地のFCSで動くから、
といってもFCSナシでも動くから、トリプシンも使わない方がよい、などの
アドバイスを受け、FCS2%程度で、付着細胞をPBSで洗ったあとに直接
溶解する方法で行っていますが、
それでも、上記二者がバンドとして見えてしまいます。

よく論文にあるfigureのように、ネガコンでリン酸化がまったく
出ないようにするコツはあるのでしょうか？
ちなみに、ブロッキングにスキムミルクは使っていません。
リン酸化タンパク用に、ということで成書を見て調合したものです。
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