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(無題) 削除/引用 No.25-16 - 2011/02/21 (月) 10:07:40 - ~ >ami（偽物） さん >次世代シーケンサーじゃだめな理由あるの・・・？ 日本だと数百万円くらいしますよね。 価格は十分な理由になると思いますが… 海外だともう1000ドルとかになっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.25-15 - 2011/02/19 (土) 15:42:17 - ami（偽物） 老師さんは書きました > 本件の問題設定の場合、同じ遺伝子座に、複数コピーの遺伝子が繰り返し構造をとって存在する可能性が高いことを暗に示唆しておる。次世代シーケンサを使うのは危険じゃ。 なるほど・・・

(無題) 削除/引用 No.25-14 - 2011/02/19 (土) 14:08:08 - 老師 本件の問題設定の場合、同じ遺伝子座に、複数コピーの遺伝子が繰り返し構造をとって存在する可能性が高いことを暗に示唆しておる。次世代シーケンサを使うのは危険じゃ。

全くコメントいただけないけど 削除/引用 No.25-13 - 2011/02/18 (金) 18:45:40 - ami（偽物） 次世代シーケンサーじゃだめな理由あるの・・・？

(無題) 削除/引用 No.25-12 - 2011/02/18 (金) 10:57:07 - 中年 多くのトランスポゾンは標的配列に制限があまりないので、挿入のイベントはほぼランダムであると期待できます。２つのコピーの同じ箇所に独立に２回挿入が起こることはまずないでしょう。 ランダムにトランスポゾンを飛ばした菌体のプールのゲノムDNAを鋳型に、目的の遺伝子とトランスポゾン内部配列のそれぞれのプライマーでPCRをし、遺伝子内部もしくは近傍に挿入を持つクローンを含むプールを選別、さらに陽性のプールを希釈して培養後、同様なPCRで陽性クローンを含むサブプールを選別、以下繰り返すことでシングルクローンを同定できるでしょう。その株でトランスポゾンの挿入を持たないコピーの有無を検討することになります。

(無題) 削除/引用 No.25-11 - 2011/02/18 (金) 08:54:04 - まちばり ご意見ありがとうございます。 ~さんやンンノさんのおっしゃるように、完全な証明はできないですが、�@の方法で複数の制限酵素でサザンブロットを試してみたいと思います。 >中年さん 方法をお示し頂き、ありがとうございます。 無知ですみません。教えていただきたいのですが、目的の遺伝子の内部または近傍に遺伝子を挿入し、確認するとのことですが、目的の遺伝子が2コピー以上あった場合も1つの部位にしか挿入されないのでしょうか。

次世代シーケンサー 削除/引用 No.25-10 - 2011/02/17 (木) 20:24:28 - ami（偽物） だめ？コピー数わかるけど、、、

(無題) 削除/引用 No.25-9 - 2011/02/17 (木) 16:40:56 - kinase 定量的PCRでその目的サンプルの入ったプラスミドを使用して絶対定量する。 そうすれば、ゲノムサンプル溶液中にあるその遺伝子のコピー数が判明し、それをゲノムの大きさと溶液に含まれるDNA量を用いて計算できないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.25-8 - 2011/02/17 (木) 14:01:49 - 中年 トランスポゾンを飛ばして問題の遺伝子の内部や近傍に挿入された株を選別し、別のコピーの有無を判断するというのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.25-7 - 2011/02/17 (木) 13:20:25 - Boston-Pullman FISHみたいのじゃダメでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.25-6 - 2011/02/17 (木) 13:07:09 - ~ 動物細胞だとDNA量ではなく、細胞数で調節したりもします。 バクテリアだと難しいでしょうけど。（ODだと精度が…） 全ゲノムを読まずに証明しようとするのであれば、”検出できた1コピー以外は存在しない”という非存在の証明をすることになりますので、”完全な証明”は無理でしょう。 �@：書かれている理由 �B：SNP等により選んだプライマーで増えない ゲノムライブラリー：ライブラリサイズを無限に増やしても抜け落ちの可能性は0には出来ず、取れにくい配列が回収できる保証もない などで、検出できなかった2コピー目を否定できません。 そのため、実際の実験としてはどうしてもトリッキーに見える部分は出てきてしまいます。 その脆弱な部分を少しでも補うために、�@で複数の制限酵素で調べたり、PCRと違って多少の変異も許容できるサザンブロット解析で調べたりします。

(無題) 削除/引用 No.25-5 - 2011/02/17 (木) 12:18:45 - ンンノ 制限酵素消化断片長や他の遺伝子との比較では、「調べた限り」という 結論にしかなりませんね。 一つしか無いことを証明するのは結構大変です。 ~さんの書かれてるようにゲノムサイズの情報が必要で、当該の遺伝子を クローニングする必要もあります。 両者の試料を厳密に濃度測定して比較してやればいいのですが、核酸試料の 濃度測定を厳密に行うのは実は結構大変です。 UV吸収や核酸染色蛍光色素はGC含量に影響されますから。 乾燥核酸試料の重さを秤で量る方法が絶対的には信用できますが、高純度の 核酸を重さを量れるほど沢山集めるのは結構大変です。 なんとか１０％程度の誤差範囲でゲノムサイズと核酸試料濃度が測定できれば ~さんの方法などで答えは得られます。 誤差が２０％だとギリギリで、３０％だとはっきりしません。 そもそも測定誤差をどうやって評価すればいいのか？ 大変なので「調べた限り」という所でまとめることが多いんでしょうね。 マル１の方法は２種類だけでは不安ですが、１０種類くらい試せば少しは 安心できます。

(無題) 削除/引用 No.25-4 - 2011/02/17 (木) 10:46:23 - AP >コピーが複数あっても同じサイズに切れたら1つのバンドとして認識されるため、完全な証明にならないと思いました。 原理的にはその遺伝子の内部を切らない制限酵素で切れば、複数コピーあったとしてもflanking sequenceにある、その切断位置はそれぞれ異なるはずであるから、長さの違いとして検出できるはず。 あるいは、たとえばその遺伝子の内部を一箇所だけ切る酵素で切り、その遺伝子の切断箇所の右側、あるいは左側をプローブにしても、検出されるバンドの長さは次に現れるfalnking sequence上の切断位置に依存するので、区別ができるはず。 その遺伝子のsequenceが解読されていれば、それをもとにどの制限酵素が使えるか決めてからできるが、そうでなくても、制限酵素地図を作る要領で、いろいろな制限酵素で切ってみればよい（シークエンスが容易ではなかったころでも、みんなそれでりっぱにやってきた）。 あとは、ゲノムライブラリーを作って、その遺伝子プローブにポジティブなクローンを網羅的にひろって、由来の異なるクローンがあるかどうかをみるとか。

(無題) 削除/引用 No.25-3 - 2011/02/17 (木) 10:37:43 - ami（偽物） �A不可能じゃないです。次世代シーケンサーで。コピー数も示せる。

(無題) 削除/引用 No.25-2 - 2011/02/17 (木) 09:19:07 - ~ ゲノムサイズの情報は持っていますでしょうか？ また、目的の遺伝子はクローニングできますよね。 コントロールとしてクローニングした配列も0.5, 1, 2コピー相当を流してサザンブロット解析を行い、0.5コピーより多く、2コピー未満であることを示してはいかがでしょうか。 問題があるとすれば、その遺伝子をプローブとした時に、相同性の高い遺伝子も検出されてしまうかもしれませんが、それは洗いの加減で調節するしかないと思います。

シングルコピーの証明方法 削除/引用 No.25-1 - 2011/02/17 (木) 09:10:59 - まちばり ある菌のある遺伝子がsingle copyか否か確認する方法を教えてください。 �@2種類の制限酵素でゲノムを切断後、それぞれサザンブロットする。 論文で�@の方法を見かけたのですが、コピーが複数あっても同じサイズに切れたら1つのバンドとして認識されるため、完全な証明にならないと思いました。 �Aゲノムをすべて読む。 不可能です。 �BリアルタイムPCRで既にシングルコピーと報告されている遺伝子と比較する。 私が調べたい菌では、シングルコピーと報告されている遺伝子がありません。 上記�@〜�B以外でよい方法はないでしょうか。 よろしくお願い致します。

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