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(無題) 削除/引用 No.247-16 - 2011/04/06 (水) 16:45:57 - ンンノ 310さんのインジェクターのお話は勉強になりました。 RI実験とかクリーンルームでの作業とかでのスキルや経験は、コンベンショ ナルなベンチワークにも活かせますね。 アルコールランプについては自分ではDNA実験で使うことはありませんが、 大腸菌実験の時などに使うのは、炎の周りに上昇気流ができて降下物 を抑えることでコンタミを防ぐと習いました。 なのでDNAの実験にも有効と思いますが、ベンチトップにホコリが無ければ という条件付きですね。

(無題) 削除/引用 No.247-15 - 2011/04/06 (水) 09:57:42 - 310 もし簡易キャビネットが入手できなかった場合、実験台の上をオキシドール程度の過酸化水素水、10倍希釈ハイター＋水ぶき、またはDNAZap(http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?9890)などで拭いた後、アルコールランプかガスバーナーを10分以上付けっぱなしにして、実験すると良いかもしれません。火をつけるのは、クリーンベンチがないところで無菌操作する際、空気中の細菌を焼き殺す方法ですが、DNAも焼かれれば鋳型として役に立つとは思えないので、次善の策としてお勧めします。ただし空気の通りの良い場所ではあまり役に立ちません。またPCR前と後を処理する場所が離れていれば、ここまでやらなくても手袋変えるとか、素手なら手を洗う程度で大丈夫と思います。

(無題) 削除/引用 No.247-14 - 2011/04/05 (火) 16:49:01 - PCR Boston-Pullmanさん、310さん御解答ありがとうございます。 簡易キャビネット内でフィルター付きチップを使用し、PCR前と後でのピペットマンを変えればコンタミのリスクは最小限になりますね。 簡易キャビネットを買ってもらえれば良いんですけど・・・・・ 今度、ラボが新しく建設された大学構内に引っ越すので改善されることを願います。

イジェクター 削除/引用 No.247-13 - 2011/04/05 (火) 14:20:05 - 310 学生時代RIを使っていたときですが、イジェクターでチップを捨てていると、しばしばチップの先がコンタミしました。当時の先生に言われたとおりイジェクターを用いず、手で柔らかに外すとコンタミしなくなりました。またRI汚染は内部の場合よりチップ外部が多かったです。 当時も今も、反応前と反応後PCR産物は別のピペットマンを使っていますが、cDNAやプライマーのコンタミの可能性を減らそうと手で外すことが多いです（フィルターチップのときはイジェクターを使います）。また気休めと思いながら、たまにオキシドールでチップの先を拭くことをしています。 nested　PCRの一回目のPCR産物はフィルターチップ＋PCR反応後用ピペットマンで扱っています。 ご参考までに

(無題) 削除/引用 No.247-12 - 2011/04/05 (火) 13:59:00 - Boston-Pullman 値段はわかりませんが、簡易キャビネットがあります。 実験台のうえに置くだけ。UVランプがついています。前面上部がガラス、下部は観音開きのドアとなり、操作はそのドアを開けて、手を突っ込む感じです。ちなみに、（たぶん値段の問題）キャビネットには底がないので、ある程度表面が綺麗な実験台に設置する必要があります。 業者さんに聞けば分かるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.247-11 - 2011/04/05 (火) 12:15:05 - PCR ンンノさん、atsさん御解答ありがとうございます。 エアロゾルによるコンタミは起こりやすいものなのですね。あまり重要視していませんでした。 現在、うちのラボではPCR反応液の調整と電気泳動を同一の部屋で行っていました。それが原因のひとつでもあるのですね？ ラボの構造上別々の部屋で行うのが難しい場合どうすれば良いのでしょうか？

フィルターチップ＋クリーンベンチ 削除/引用 No.247-10 - 2011/04/05 (火) 10:58:40 - ats 以前うちのラボでも困った時がありましたので、ご参考になれば。 primer・酵素液の汚染・ピペットマンの汚染等を経験し、それを改善して、さらに白衣・作業員も代えてみたりしてもダメだったときがあります(2~3ヶ月で毎回ではないがnegative controlが陽転した)。使用後のゲル・泳動bufferの処置を普通に行っていたため、部屋の空気(おそらく塵や埃）を汚染してしまったのが原因のようでした（ゲルはゴミ箱、泳動bufferはEtBr吸収後流しへ廃棄）。そこで、電気泳動を行っていた部屋とは違うところで、PCR反応液を調製すると解決しました。 その後、汎用するPCRの時は、 ピペットマンもPCR専用に確保する(電気泳動には使わない） フィルターチップを使用する 試薬類・チップ・チューブもクリーンベンチ内で開封する（可能ならその反応専用にする） クリーンベンチ内でのPCR反応液を調製する （nasted PCRの場合、泳動も別の部屋で行い、使用後のゲル・泳動bufferもその部屋で処分する。） を徹底すると、被害は出なくなりました。 ここまでしなくても、クリーンベンチの使用が有効だと思います。

(無題) 削除/引用 No.247-9 - 2011/04/04 (月) 15:13:49 - ンンノ エアロゾルによるコンタミは、実験によっては無視できない場合がありますよ。 それで水や酵素液をコンタミさせてしまうと大変です。

(無題) 削除/引用 No.247-8 - 2011/04/03 (日) 20:28:00 - PCR ンンノさん御解答有難うございます。 現在フィルター付きチップは使用しておりませんが、今後使ってみようかと考えています。その方がよりコンタミのリスクは減りますよね。

(無題) 削除/引用 No.247-7 - 2011/04/03 (日) 19:41:56 - ンンノ フィルター付きチップを使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.247-6 - 2011/04/03 (日) 15:50:57 - PCR 解答して頂いた方々、誠にありがとうございました。 コンタミが原因であることは自分も考えてはいましたが、自分的にはコンタミのリスクが最小限となるように注意して操作していたつもりです。 なので、どの過程でコンタミが生じたのかが検討つかないので質問させていただきました。ちなみに操作法は次の通りです。 最初にtemplate DNAを除いた試薬を混合したMixtureを調整し、PCRチューブに分注した後に最後にtemplate DNAを添加してピペッティングし、PCRを行いました。 ネガコン、ポジコンの順にサンプルの調整を行いました。その理由としては、もしポジコンサンプルを扱ったチップでネガコンサンプルを扱うようなことがあれば、そこでコンタミが生じるリスクがあると考えられるからです。（もちろんサンプルの調整順に関わらず、試薬及びサンプルごとにチップは変えています。） 二回目のPCRでも、nested primerを含むmixtureをPCRチューブに分注した後に、一回目のPCR産物をtemplateとして加えPCRを行いました。 原因としてはピペットマンが汚染されていて、ピペッティングによりピペットマンに付着しているDNAがコンタミしたと考えるのが無難なのでしょうか？ また、この操作法よりもコンタミのリスクが最小限となるような操作法がありましたらご教授頂きたいのですが宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.247-5 - 2011/04/03 (日) 12:47:08 - 774 ネガコン置いといてここでその質問をする意味が・・・ そういうことを含めて明らかにしてくれるネガコンでしょ。

(無題) 削除/引用 No.247-4 - 2011/04/03 (日) 00:05:25 - AP negative controlであれば、鋳型DNAを入れた本実験とside-by-sideでやっていることでしょう。で、コンタミのソースは本実験で増えたPCR産物と、

(無題) 削除/引用 No.247-3 - 2011/04/02 (土) 23:55:12 - AP ですね。

(無題) 削除/引用 No.247-2 - 2011/04/02 (土) 23:13:57 - コンタミ コンタミ

nested PCR 削除/引用 No.247-1 - 2011/04/02 (土) 21:24:57 - PCR 現在、研究でnested PCRを行っています。PCR後に電気泳動してみると1回目のPCRではnegative controlとしてtemplate DNAの代わりに滅菌水を用いたサンプルからは特異的DNA産物が見られなかったのにも関わらず、1回目のPCR産物を基にnested primerを用いて行った2回目のPCRではnegative controlである滅菌水から特異的DNA産物と見られるバンドが検出されました。 この結果が得られた原因としては何が考えられるのでしょうか？

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