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(無題) 削除/引用 No.245-12 - 2011/04/06 (水) 08:38:13 - himawari >こんな特殊なバッファーって何に使うのですか? 核酸の抽出と保存です。

(無題) 削除/引用 No.245-11 - 2011/04/06 (水) 00:21:41 - EE11 >[Re:10] himawariさんは書きました : > 8M Urea入りの特殊なbufferでgenomic DNAとmtDNAを3年間室温遮光下でほったらかしにしておいても自分の実験系には影響なかったです。 こんな特殊なバッファーって何に使うのですか?

(無題) 削除/引用 No.245-10 - 2011/04/04 (月) 19:29:53 - himawari 8M Urea入りの特殊なbufferでgenomic DNAとmtDNAを3年間室温遮光下でほったらかしにしておいても自分の実験系には影響なかったです。

(無題) 削除/引用 No.245-9 - 2011/04/04 (月) 13:24:23 - bluehornet DNA抽出キットの宣伝みたいになってしまいますが、僕が使っているQIAGEN社から出ているGentra Puregene Kitや5 PRIME社のArchivePure DNA Purification Kitでは「抽出後のDNAが4℃で14年間分解せず」と謳っていますよ。 bufferの組成はマニュアルをぱっと見た所では不明ですが、やはり保存時のbuffer等の影響は大かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.245-8 - 2011/04/03 (日) 11:05:39 - xyz PCR反応後のサンプルの保存については、 APさんが仰るように、 3' exonuclease活性を持つDNApol（Pfu、PrimeSTAR、KODなど）は、 反応終了後は、すぐに電気泳動か、−２０度保存です。 普通のTaq DNApolの場合、４度で１晩くらい置いておくのは、問題無かったですが、 同じ感覚で、PrimeSTARで反応したものを、４度で置いておいたらPCR産物が消えてました。 （その失敗をしてからは、PCR反応後すぐにPCRマシーンから回収しています。） プラスミドＤＮＡは、 チューブのキャップがしっかり閉まるタイプなら４度でも保存しますが、 基本は−２０度に置いています。 よく使うサンプルは、過度の凍結融解を避けるため、小分けに分注しています。 プライマーは、ＴＥに溶解して４度で保存してます。 ３年くらいはもってます。（qPCRでも問題無い場合が多い）

(無題) 削除/引用 No.245-7 - 2011/04/03 (日) 08:18:22 - EE22 EE11さんへ >よくあるシーンとして、金曜日の夜にPCRをかけて、そのまま4℃で放置。 ちょっとお聞きしたいのですが、4度と言うのは冷蔵庫ですよね？ もしPCRマシンでしたら、個人的には 電気代、および、マシンへどのくらい負担がかかるか？がよく分からないので、止めて下さいとお願いすると思います。

(無題) 削除/引用 No.245-6 - 2011/04/02 (土) 23:53:39 - AP >私のラボでは4℃で保存するのは1日までって言われているのですが、私はその根拠がわからず、このトピを見て質問させていただきました。 最近のPCR用酵素は校正活性のあるものが主流ですが、反応終了後放置すると、3' exonuclease活性によって末端の削れ込みが起こります。放置が短時間であれば、電気泳動で見ても大きな変化は見られないですが、もともとbluntであるべき末端が3'陥没末端になってしまいます（その意味では4℃で一日というのも長すぎだと思います。それくらいになると電気泳動でも変化が現れてくるのではないでしょうか）。こうなるとblunt-end ligationの効率が著しく悪くなりますし（逆に反応後速やかに酵素活性を除去するなら、十分に高い効率でligationできるので、わざわざTaqで末端にAを付加してTA cloningするようなことをする必要がない）、プライマー末端に設計した制限酵素認識配列がつぶれたりします。

(無題) 削除/引用 No.245-5 - 2011/04/02 (土) 23:29:39 - EE11 よくあるシーンとして、金曜日の夜にPCRをかけて、そのまま4℃で放置。月曜日に来て電気泳動って事があると思うのですが、PCR産物って安定ですか? 反応による熱でDNaseは失活し、またバッファー中ですので安定だと思うのですが・・・ 私のラボでは4℃で保存するのは1日までって言われているのですが、私はその根拠がわからず、このトピを見て質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.245-4 - 2011/04/02 (土) 16:33:49 - Actias あくまでも事例ってことで。 アルカリSDSで組織溶解して、proK、フェノ抽、RNaseA、フェノ抽、エタ沈と処理したマウスゲノムDNAで、忘れていて冷蔵庫に２年間放置していたのが、1%アガロースで泳動してみたら、取った当初の泳動像と比べてほとんど壊れてなかった。 プラスミドは、机の上に放置していることが多いけど、その次のステップは、増やし直しなので、問題を感じたことはありません。 紙とか樹脂にプラスミドを吸着させて室温保存する製品がありますが、同じように、増やし直すことを前提とすれば、製品表示の保存期間で問題ないと思います。 大事なプラスミドは、分注して、-20℃です。

(無題) 削除/引用 No.245-3 - 2011/04/02 (土) 15:39:57 - 774 gDNAはマニュアルで回収してフェノクロしたものを使っており、基本的に-20℃保存してます。 しかし、凍結融解を繰り返したり、４℃・室温に長期間置いておくとPCRがかかりにくくなる印象を受けます。 何日かといった具体的なことまでは言えないですが。 ４℃保存したいのであればworking dilutionのものを小分けにして、使う一本以外は凍結しておくというのも良いのではないかと。 プラスミドなどは室温に１週間ぐらい置いてたりとかたまにありますが、特に問題を感じたことはないです。用途によると思いますが・・・。それ以上の期間はわからないです。 プライマーとか基本的に室温に置いてますし、cDNAも室温に何日か置いておいたものでもちゃんとPCR・qPCRかかります。 まぁ根本的なことを言えば、後々実験が上手くいかなかった時に「4℃に長期間保存してたからかな・・・？」といった感じに不安になりたくないのであれば余計なチャレンジはしないのがベストかと・・・ 何事もそうですが、上手くいっているシステムを無理に崩す必要はないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.245-2 - 2011/04/02 (土) 14:36:51 - 310 キアゲンで精製したゲノムDNAを短めのPCRに使ってましたが半年位4度でもちました。1年超えると増えなくなります。 サザンのトピックで書いたややこしいDNA抽出法で取ったやつをTEに溶かし常温においてましたが、1年以上たって数ｋｂのサザンでRFLPを見るのに使ったような記憶があります。 大事なDNAはエタチンしたまま-20度保存しています。 汚いDNAやマグネシウムを含んだ溶液はDNAseの分解が怖いので凍結保存。ニックが入ると嫌なのは、小分け凍結かエタチンです。

DNAの保存温度と期間 削除/引用 No.245-1 - 2011/04/02 (土) 12:15:17 - vtec あまり大した質問でないのですが、 DNAを保存する場合、4℃、-20℃、-80℃のいずれかで保存する場合が一般的 だと思います。 長期保存ですと、-20℃、-80℃が一般的ですが、4℃での保存期間の目安っ てどれくらいでしょうか？ 4℃の場合、数か月保存できると言う方と数日ももたないと言う方がいらっし ゃいます。みなさんの経験的に4℃では何日ぐらい保存できるのでしょう か？また、PCRにかけた直後のサンプルや、精製したサンプルなど、サンプル の種類や溶解しているバッファーによっても強く影響を受けるのでしょう か？

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