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ついでに 削除/引用 No.238-11 - 2011/04/05 (火) 21:49:11 - 123 ソーティングもすれば1クローンは取れますね。

(無題) 削除/引用 No.238-10 - 2011/04/05 (火) 18:20:46 - cira みなさんありがとうございます。 polyA配列の前で切ってはいません、もとのベクターは理研バイオリソースセンターから購入したものでpMFGのベクターからPCRでとってきたものに酵素サイトを付加したものです。シーケンスを解析し配列が正しいことは確認しています。 NKさんのおっしゃるようにフローサイトで確認してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.238-9 - 2011/04/02 (土) 23:20:50 - NK 環状で導入した場合は多コピーの遺伝子からDsRedが発現することになるので、発現量が多くなりやすいと思います。一方でリニアーにした場合は、ゲノムに組み込まれるコピー数はそんなに多くならないとお思いますので、発現量はほとんどの細胞で少ないと思います。 ciraさんも書かれているように、薬剤スクリーニングで樹立した株はDsRedの蛍光が見られないけれどもRT-PCRで見えるとのことですが、DsRed、特にIRES下流で発現量が低い場合に蛍光顕微鏡で見たときの感度はその程度だろうと思います。 DsRedの発現を蛍光として確認したいのであれば、蛍光顕微鏡ではなくフローサイトメーターを使うのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.238-8 - 2011/04/01 (金) 22:42:49 - Boston-Pullman > ポリAのまえで切ってるとかないよね。。。 （別のベクターから目的遺伝子をとってきたと仮定した場合）逆にポリAシグナルごと移してしまうとIRESの前でmRNAが途切れてしまうので、目的遺伝子は発現していてもDsRedの蛍光が検出できないのかなと。

(無題) 削除/引用 No.238-7 - 2011/04/01 (金) 22:22:43 - おお あ、環状だとはつげんするんだ。環状でも安定導入株は取れるけど。。。 ポリAのまえで切ってるとかないよね。。。

(無題) 削除/引用 No.238-6 - 2011/04/01 (金) 19:04:21 - Boston-Pullman 目的遺伝子はpcDNAのような他のベクターから移し変えたものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.238-5 - 2011/04/01 (金) 15:06:55 - 実験大好き プラスミドのままでトランスフェクトすると、発現が見えるということなので「cira」さんの問題解決にはなりませんが、「おお」さんのコメントに追加です。IRESのあとの開始コドンの位置は非常に大事で、IRESの配列終わりあたりとそのあとの数塩基でKozak consensus translation initiation siteを構成し、その後にATGコドンが来るのが一番発現が高くなります。そうでないとかなり発現が落ちます。よって、「cira」さんのIRES-DsRedのつなぎ方は正しそうですね。

(無題) 削除/引用 No.238-4 - 2011/04/01 (金) 14:54:26 - cira ご返答ありがとうございます。 目的遺伝子は発現していません。 IRESの後すぐにATGが入っています。間には3bpくらいしかありません。

(無題) 削除/引用 No.238-3 - 2011/04/01 (金) 12:19:11 - おお お示しの情報だけでは雲をつかむようなかんじですが。IRESのあとの開始コドンの位置が重要という話を聞いたことがあります。自前でIRESやDsRedを挿入したのであれば一度チェックした方がいいかもしれません

(無題) 削除/引用 No.238-2 - 2011/04/01 (金) 11:46:25 - Boston-Pullman 私だったら、並行して環状プラスミドを導入したstable lineを樹立します。 ちなみに、目的遺伝子はSTO親株には発現していないですよね？

IRES配列について 削除/引用 No.238-1 - 2011/04/01 (金) 11:09:13 - cira 現在STO細胞へ遺伝子をエレクトロポレーション法を用いて遺伝子を導入しているのですが、その際プラスミドをリニアライズして導入しゲノムに組み込まれた恒常発現株を樹立しようとしています。 その際IRESの配列化にDsRedを配置しているのですが、何度エレクトロポレーションしてもDsRedの蛍光が見えません。 しかしリニアライズせずに環状で導入すると確認できます。 リニアライズするときの制限酵素により、DsRed配列が切れているかと考えましたがそうではないようです。 単に発現が弱いだけなのかなんなのかわかりません。 しかし薬剤スクリーニングにより樹立した株は、DsRedは見えませんがRT-PCR法によって導入遺伝子の発現が確認できます。 何か良いアドバイスがありｍしたらよろしくお願いいたします。

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