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(無題) 削除/引用 No.236-9 - 2011/04/07 (木) 09:04:45 - サザンブロット おおさん、直接法さん、774さん、投稿ありがとうございます。 直接法さんのおっしゃるように、私の手元にも96穴プレートで直接DNAを抽出し、乾燥後、そのまま凍らせてあるものがあります。これを使用してサザンで当たりを見つけるというのもいいのですが、私がサザン初心者であり、また96穴のためDNAの量が少ないので、リスクが高いので、774さんのおっしゃるPCRでスクリーニング、RIラベルでのサザンで確認という方法で行おうと思っています。ただ、どちらにしろ最終的にはサザンで確定かと思うので、そのときのためにまずプローブの確認をと思って初めてのサザンをやるところでして、サザンにはRNase処理が必須かどうかが気になっておりました。 色々と勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.236-8 - 2011/04/03 (日) 13:04:09 - 774 KOマウス作製をルーチンにやってます。 ESをスクリーニングする時はまずPCRして、positiveなクローンだけサザンしてます。 うちの系ではRNase処理は特にしていませんが問題はありません。 方法としては、上に書いたようにサンプルが少ないので、proK処理・フェノクロ・制限酵素処理といった感じです。全てtubeで行っています。 おおさんがおっしゃっているように、DNA量が少ないと検出が難しくなってしまうので、うちでは１サンプル３０マイクロg程度使います。なので、gDNAを回収するためにESは6センチ〜10センチdishまで増やしています。 ESのgDNAはコンストラクト作製の時のテンプレートとして使ったり、サザンのプローブのチェックやネガコンに使えたりと、KOマウス作製においては必要なものです。多めに持っていても困らないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.236-7 - 2011/04/02 (土) 03:51:24 - 直接法 ご存知かもしれませんが、ES細胞のスクリーニングなら、細胞を培養した96-wellプレートの中で、直接細胞をProteinase K処理、エタ沈、制限酵素処理する方法が結構用いられていると思います。制限酵素処理の時にRNase処理をします。 一つ一つのクローンをチューブにとって、、、てやると大変ですが、この方法ならプレート2-3枚くらいでも難なくできます。フェノクロも不要です。 RI標識だと問題なく検出できますが、DIG標識とかだと感度はちょっとわかりません。 コントロールの細胞株も同じ方法でDNAを調製すれば簡単だと思います。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.236-6 - 2011/04/02 (土) 01:54:30 - おお サザンは比較的難しい実験です。検出系にもよりますがDNA量が通常より少なくなると可也検出限界に近くなってきます。さらに細胞のRNAの量は以外と多いのも事実です。 慎重にきれいに取る方がいいと思います。汚いと完全に切れない可能性もありますしそのため、目的の制限酵素できってさらにフェのクロかけて念のためもう一度というのもしたことがあります。 どなたか核ぶんかくをかいしゅうしてから精製と書かれてますがこれもいいアイデアと思います。

(無題) 削除/引用 No.236-5 - 2011/04/02 (土) 00:23:14 - サザンブロット TK-1、おお、310さん、投稿ありがとうございます。 実験の詳細をお伝えしていなくてすいません。 今、遺伝子改変マウス樹立のためのES細胞のスクリーニングのためにサザンブロットを行おうと思っています。そこで、まずはプローブの確認とESからのDNAが貴重なためサザンブロットの練習も兼ねて、細胞株からのDNA、ならびに同系マウス由来のDNAを用いて行おうと思っています。 サザンブロットを行う上の基本として、PCRに比べ精製度の高いDNAを用いる必要があるとのことですので、RNAの除去が必要かどうか考えておりました。スクリーニングですので定量性は必要ないかと思いますので、TK-1さんのおっしゃるようにRNA除去は必要ないと考えてよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.236-4 - 2011/04/01 (金) 10:59:34 - 310 大昔にいたラボでは、フェノール抽出後に透析チューブをTEにつけてフェノールを抜いた後で透析しながらRNAse処理を行っていました。その後フェノクロエタ沈したDNAを制限酵素処理してました。分解したRNAが抜けるので濃度も正確だし制限酵素も切れやすい、データもきれいになるとボスに言われてやってました。他のラボではここまで手をかけるプロトコールは見たことがないのですが、そこのラボのサザンのデータは確かにきれいでした。DNAのメチル化をサザンで見ようとしていたため、万が一にも結果に影響を及ぼすかもしれないものを排除したかったのかもしれません。 全血の細胞膜をTritonX-100で溶解し、核沈降をしてRNAse処理をはぶいたこともありますが、こっちはサザンやってないのでよく分かりません。RNase処理なしのgDNAの定量はエチジウムと複数の濃度に希釈したgDNAを混ぜトランスイルミネータにしいたラップの上に置き、λDNAをスタンダードにして、撮影して決めてました。RNAはあまり光らないので、ODで計るよりはましだと思います。 プレートリーダがあれば、InvitrogenにQuant-ITという製品があり、RNAが混入しているDNA溶液でもDNAのみの濃度を測ってくれます。

(無題) 削除/引用 No.236-3 - 2011/04/01 (金) 10:38:08 - おお すでに指摘がありますがDNAの定量ができなくなりますよ。 DNA量にもよりますがこの方法はえたチンしたあと解けにくくなることがあります。私はウレアが6Mぐらい入った状態で酢酸ナトリウムでエタチンかイソプロチンすると思います。ゲノムはやったことがないのであまり確かではないのですが、いがいとプラスミドとかは綺麗になるので。 そう言えばウレア存在下でもPKは活性があるらしいです。どの位のウレアの量まで大丈夫か分かりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.236-2 - 2011/04/01 (金) 08:49:58 - TK-1 きっちり定量する必要があるのなら、やらないといけない（RNAが残るとトータルの核酸量としては多めに出るので）ですが、酵素消化や電気泳動、ブロッティング、ハイブリダイゼーションに関してはどっちでもいいです。 フェノクロもどっちでもいいです。ESのスクリーンのときなんかフェノクロはしません。ただやらないとDNAが少し解けにくいです。

サザンブロット用ゲノムDNA抽出時にRNase処理は必要？ 削除/引用 No.236-1 - 2011/04/01 (金) 05:41:02 - サザンブロット いつも勉強させていただいています。 初めてサザンブロットを行おうと思っているものです。細胞株からゲノムDNAを回収しようとしているのですが、その際にRNaseの処理は必要でしょうか？ 最初に100mM Tris, 5mM EDTA, 0.2% SDS, 200mM NaCl, 200ug/ml Proteinase Kで55℃、O/Nで処理したのちに、フェノクロ抽出、イソプロ沈で抽出しています。精製したDNAをRNase処理するべきかについて、ご経験のある方教えていただけますでしょうか？

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