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(無題) 削除/引用 No.23-9 - 2011/02/16 (水) 12:50:59 - ウエスター ３５Ｓプロモータは大腸菌の中でも動くので融合蛋白質ができるはず。とりあえず、発現ベクターの構築に用いた大腸菌をポジコン、空ベクター大腸菌をネガコンとして実験してみたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.23-8 - 2011/02/16 (水) 05:32:02 - Boston-Pullman Actiasさんがすでに指摘されていましたね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.23-7 - 2011/02/16 (水) 05:25:02 - Boston-Pullman > GFPと結合させたタンパク質が転写因子であり、元々低発現なので、ウエスタンでは検出できないという可能性も高いです。（ボスはこの可能性を1番指摘しています。） 指導者が１番に指摘する場所ではないです。低発現なのは内在プロモーター活性によるところが大きいからで、今使用しているプロモーターは強力なはずですから。分解され易いとか、高発現では細胞毒性を示すということなら話が変わってきますが。 ボスと確認して実験を行っておられるようですが、それに安心しないほうが良い気がします。初歩的なミスを起こしていないか（フレームがあっているか等）、どこまでちゃんと確認できていますか？

(無題) 削除/引用 No.23-6 - 2011/02/15 (火) 22:48:59 - Actias 操作が見えん。 >GFPを蛍光標識とし融合タンパク質を作成した後、形質転換、シークエンスを行いました の形質転換は、発現ベクターを得るためのクローニングのための大腸菌の形質転換ですよね？ >両者アミノ酸はVであり、ウエスタンをする上で大きな影響は出ないと考え、実験を進めたのですが、出てほしい位置にバンドが出ていませんでした。 も、宿主に遺伝子導入しているはずですが、大腸菌でなく細胞（植物？）ですよね？ 形質転換効率はどうでしょうか？ また、配列の確認はできていますか？ 単にホモロジーが高い結果が出たとかでなく、つなぎ目が問題ないとかどうとかのレベルですが。ボスの指導の下なら、心配ないと思いますが、可能性として。

(無題) 削除/引用 No.23-5 - 2011/02/15 (火) 21:49:48 - fuy 皆様、返信本当にありがとうございます。 レアコドンかどうか等、調べてみます。 蛍光観察の件も、早速他のラボに蛍光顕微鏡を借りるお願いをしてきました！ 様々な要因が考えられるのですね… 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.23-4 - 2011/02/15 (火) 19:37:28 - nnn コントロールの、35Spromoter - GFPのみ　は、どのような結果でしょうか？ mRNAの塩基が違う事により、たとえ同じアミノ酸をコードするものであっても、 そのコドンが、その細胞にとってレアコドンであったら、 mRNAからタンパク質への翻訳速度が遅くなる事はあります。 （その結果、タンパク量の発現量が低下する） 生物種（もしくは細胞ごと？）によって、レアコドンは異なります。 大腸菌など報告されているものもありますが、 まだまだ、未知なものもあるので、私は、目安として http://www.kazusa.or.jp/codon/ のサイトを見て考えています。 もちろん、35Spromoterは、実験に使っている細胞？（植物？）で、 活性を持つ事は、明らかなのですよね？ あと、 >GFPと結合させたタンパク質が転写因子であり、元々低発現なので、 >ウエスタンでは検出できないという可能性も高いです。 >（ボスはこの可能性を1番指摘しています。） ですが、何か聞き漏らしてはいないでしょうか？ （タンパクの半減期とか、分解速度とか・・・。）

(無題) 削除/引用 No.23-3 - 2011/02/15 (火) 19:13:14 - aimar まずは、他のGFPタンパクが検出できるかを実験してみたらいいのでは？ラボで誰かがやっていたものが残ってたりしませんか？ 生物ごとにcodon usageが異なると思うので、バリンをコードするコドンにおいてGTAがマイナーかどうか調べたら良いと思います。 レアコドンなら発現しないかも!? もしくは、その調べようとしているタンパク質の他のバリンは何にコードされているのでしょうかね？ コドンとは別の可能性で、どのようなサンプルを使っているのかわかりませんが（whole cellとかなら別ですが）、不溶性画分にいっちゃってるという可能性はないでしょうか。 ウエスタンで見えないものが顕微鏡で見えるという現象に出会ったことはないですが、ばいやさんのおっしゃるように蛍光観察もしてみては？

(無題) 削除/引用 No.23-2 - 2011/02/15 (火) 19:02:52 - ばいや 転写が上手く行っていないのかな？ 核酸と結合しているとか？ 蛍光はどうなっている？ サンプルは何？ 抗体は何？ コドンは関係ないと思われ 余程宿主にマイナーなコドンならありうるけど。

ウエスタンブロットでの検出 削除/引用 No.23-1 - 2011/02/15 (火) 18:35:16 - fuy 初めて質問させて頂きます。 シークエンス・ウエスタン等を行って1年目の初心者です。 GFPを蛍光標識とし融合タンパク質を作成した後、形質転換、シークエンスを行いました。（35Spromoter、GFP、目的タンパク質の順です。きちんと当たりバンドが出たものをシークエンスに依頼しました。企業に依頼しています。） その結果、GFPのコドンにおいて、GTGのところがGTAと読まれていました。（その他のところは相違なしです。） 両者アミノ酸はVであり、ウエスタンをする上で大きな影響は出ないと考え、実験を進めたのですが、出てほしい位置にバンドが出ていませんでした。 ウエスタンは2回行い、1回目は全くバンドが得られず、2回目はより高感度の抗体を用いましたところ、分解されたのかな、と推測されるようなバンドは検出されました。（全長の長さではありませんでした）。 実験操作上はボスがほとんど一緒に見ていて下さっており、使用する試薬等もボスの指揮の下行いましたので、これらのミスはないと思います。 GFPと結合させたタンパク質が転写因子であり、元々低発現なので、ウエスタンでは検出できないという可能性も高いです。（ボスはこの可能性を1番指摘しています。） Real time PCRでやってみる、再度タンパク質の量を増やしてウエスタンを行う、という方法を考えていますが、もしかしたら上記のコドンの相違が関係するのでは…と懸念しています。 アミノ酸は同一でもコドンの違いで影響は出てくるのでしょうか。 また、もしこの影響が考えられないとしたら、やはり上記に挙げたことが原因でしょうか。 長い文章となってしまい、大変申し訳ありません。 どうぞよろしくお願い致します。

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