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(無題) 削除/引用 No.222-10 - 2011/04/02 (土) 04:19:30 - kawabat Boston-Pullmanさんご意見ありがとうありがとうございました。 他、アドバイスをくれた方、ありがとうございました。 これらのアドバイスを参考に予備実験を行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.222-9 - 2011/04/01 (金) 01:20:43 - Boston-Pullman 葉の断片と試薬をエッペンにいれて、コールドルームで１０分ほど転倒混和するのはどうでしょうか。組織の崩れ具合でインキュベーション時間を決めればよいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.222-8 - 2011/04/01 (金) 00:33:16 - kawabat ご意見ありがとうございます。 表面積や重量当たりというのは、全く考えていませんでしたが、同じ時期の植物から同じグラム数の葉をとれば、いいかなと思ってました。植物の器官を変えるなら、なるほど確かに、同じグラム数でも菌が付着する表面積が異なるから、植物器官内で比較するときには、考慮しなくてはならない点であることに気が付かされました。ありがとうございます。 やはり、みなさんおっしゃるように、「植物器官を洗い流した溶液」をサンプルとしてみる方向性を考えてみたいと思います。 Boston-Pullmanさんの「表面だけ抽出用（フェノール系）試薬処理」というのはどういった方法なのでしょうか？参考にしたいので、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.222-7 - 2011/03/31 (木) 09:38:54 - ンンノ 器官が光合成器官なら光合成阻害系の除草剤で植物細胞だけ殺せばいいような 気がします。

(無題) 削除/引用 No.222-6 - 2011/03/31 (木) 04:40:02 - Boston-Pullman インターナルコントロールは重要ですが、もし「器官ごとに」という表現が葉、茎のことを指すのであれば、植物由来DNAをコントロールにするのは問題があるように感じます（門外漢ですが）。 というのも、薄い葉のようなサンプル１ｇとブロック状のサンプル１ｇは菌体が付着する表面積がことなるからです。つまり、同じ１ｇのサンプルであっても、ブロック状のサンプルでは菌が存在する確立は薄いサンプルと比較して数倍低いはずです。 表面積あたりの菌体数を示すのが研究目的に合う感じがします。そうなると表面だけDNA抽出処理しても問題ないです。あくまで表面積を計算できればの話ですが。

(無題) 削除/引用 No.222-5 - 2011/03/31 (木) 00:26:36 - おお やはり私もその植物のDNAを持ち込まない方法で回収するほうがいいと思います。使う植物重量を一定にして、重量あたりのコピー数でいいのではないかとおもいます。インターなるコントロールはいろいろな視点で取られることがあるのでいろいろと考慮する必要はあると思いますが、植物を洗った溶液に一定量酵母DNAなどを入れるとすると、精製過程のぶれを修正するコントロールといえると思います。

(無題) 削除/引用 No.222-4 - 2011/03/30 (水) 21:34:53 - kawabat ご意見ありがとうございます。 菌を増殖してから検出というのが過去の論文でありまして、植物体を一度、冷蔵してから適度な温度環境にもどし、菌を増殖してから測定するという方法をとっていました。しかし、初期段階で付着していた菌の定量性がいまいちになってしまうのと、時間がかかってしまうのが欠点になってしまいます。 植物体の表面を洗って、というのはいい方法に思えますが、その場合、インターナルコントロールがなくなってしまいます（植物ごとすりつぶすと、植物体のDNAをインターナルコントロールにできます）。既に報告されている方法では、植物体を洗い流し、その洗い流した溶液に後から、Yeastを入れて、Yeast DNAをインターナルコントロールとしているものもありました。Yeastじゃなくても何か全く関係のない既知量のDNAを加えることで、インターナルコントロールとしていいのであれば、試してみたい方法でもありますが、これは可能でしょうか？ RNAならば、real-time PCRの機械を使用してもできるので、こちらも検討してみます。 ご意見ありがとうございます。引き続きアドバイスをお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.222-3 - 2011/03/30 (水) 10:34:25 - ~ 門外漢ですが。 PCR→ダイレクトシークエンシングで同定などではなく、 real-time PCRだけで検出できるということは、目的となる菌の範囲は決まっているのでしょうか。 そうであれば、 １．菌を培養して増やしてから検出する ２．DNAよりも1個体あたりの分子数が多いRNAやたんぱく質を検出する ３．植物と分ける（すりつぶした上でメッシュやパーコール？） などの増幅、検出対象の分子の変更、分離などで検出しやすくなるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.222-2 - 2011/03/30 (水) 09:28:08 - Boston-Pullman 植物に付着している糸状菌とのことなので、器官ごと液体窒素下ですり潰してではなく、表面だけ抽出用（フェノール系）試薬処理すれば、菌体に由来するDNA濃度が高くなり、検出しやするなるかと思います。

病原菌DNAの高感度検出方法 削除/引用 No.222-1 - 2011/03/30 (水) 05:38:53 - kawabat 野外で栽培されている植物に付着している糸状菌DNAの高感度検出方法を模索しています。 植物器官ごと、液体窒素下ですり潰して、DNA抽出を行い、そのDNAサンプルをreal-time PCRに供試して、植物に付着している糸状菌を検出しようとしています。 real-time PCRでは、TaqManを使用するつもりですので、特異性はあるのですが、いかんせん、「多量な植物のDNA」vs「微量な糸状菌のDNA」では感度がいまいちになってしまいます。 real-time PCRを用いての、こうした病原菌DNAの検出方法はたくさん報告されてあるものの、やはり、どれも感度の点で行き詰っているように思います。 そこで、どのようにしたら感度を上げることができるのかについて、アドバイスをいただきたく思いトピックを立てました。植物、動物、医学、さまざまな分野からアドバイスいただけると幸いです。 よろしくおねがいいたします。

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