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(無題) 削除/引用 No.208-6 - 2011/03/29 (火) 05:53:36 - Boston-Pullman 遠心の条件によると思うのですが、14K rpm では膜画分（界面活性剤なし、ソニケーションのみ）は沈殿します。上清を回収した際、沈殿物が確認できたかと思います。 発現させたタンパク質が本当に上清に存在するのか確認することをお勧めします。

アドバイスありがとうございます。 削除/引用 No.208-5 - 2011/03/28 (月) 20:35:40 - たろうちゃん ご指摘ありがとうございます。 反応は解糖系の反応物を見ております。 またポジコンも目的たんぱくと全く同様の発現および処理の仕方をしております。ネガコンとして空のベクターをトランスフェクションしたものを使用しております。 　結果は目的タンパクの反応は空ベクターのネガコンと同じになります。 つまり、活性がないのかそれともソニケーションした溶液で不溶状態でいて活性が出ていないのかのどちらかということになると思うのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.208-4 - 2011/03/28 (月) 09:11:09 - おお 塩はそれぞれたと思いますがイオン強度だけを考えるならNaClかKClで十分だと思います。濃度も実験によってそれぞれでまあ感覚的には1Mまで使うのはほとんどないだろうなぁと思いますが、これもターゲットによると思いますのでよく分かりません。 Liイオンはカオトロピックな作用がありますので可溶化で使われることがあります。カオトロピックアニオンも選択肢かもしれませんがたまに使われていますがいろいろな意味でちょっと扱いにくいようなきがします。 1MくらいのTRISでまく表剤タンパクを遊離させたという報告もありTRISにも弱いがそういう作用があるのではないかという議論も見たことがあります。いずれにしろターゲットによって挙動が違うというのはあると思いますので必ずしもほかのタンパクで使えるというのは難しいです。

(無題) 削除/引用 No.208-3 - 2011/03/28 (月) 02:01:16 - おお まず発現量はポジコンに比べてどうでしょうか。膜にあるならサイトゾルに発現するよりかなり落ちる可能性はあるとおもいます。ターゲットの酵素の量をそろえて活性をはかってポジコンで測定可能でしょうか。 細胞膜にあるのであれば、通常の遠心ではちんでんせず、溶液のフラクションにあるような気がしますので、でタージェンとを使わなくてもはかれるようなきがします(膜に存在することで活性が抑制されていなければ、もしそうだったら面白いとおもいますが)。逆に超遠心で膜フラクションを回収すると濃縮され活性がはかりやすくなるかもしれません。 ちなみにミトコンドリアの膜に存在するなら10000g位で落ちてきます。 一般によく使われるでタージェンとはTRITON-100, NP-40, deoxcholate, chapsなどだとおもいます。すべてタンパク質(特に可溶性球状タンパク)にはマイルドであるということになっていますが、すべてのタンパクに当てはまるわけでもありません。ポジコンに加えて影響があるかどうか確認が必要と思えます。 膜を完全に可溶化する能力は乏しいですけどtween-20/80、digitoninといったでタージェンともあり、表層のタンパクであれば解離させることができるかもしれません。 キ吸収についてはそれぞれ調べてほしいのですが、可視こうではすべて吸収は非常に低いです。TRITONー100、 NPー40、はUV領域につよい吸収があります。tween-20/80はUVにきゅうしゅうはないですが、そのたはおぼえていません。 えん、そのた についてはまたあとで(ちょとPCのじょうたいがわるくへんかんできなくなったので)

(無題) 削除/引用 No.208-2 - 2011/03/27 (日) 20:58:36 - yyy 差し支えない範囲でもう少し実験の詳細を書いたほうが良いと思います。 その酵素活性とは大まかにどういう反応なのか、例えばリン酸化とか脱リン酸化とかプロテアーゼとか。とか、ポジコンはどういう系なのか、おなじくoverexpressinさせてソニケートして活性を同様に測ってるのか？とか。 　 機能と膜局在の関係についてはタンパクによって違うので一般論では言えないと思います。

タンパク質の酵素活性と可溶化について 削除/引用 No.208-1 - 2011/03/27 (日) 18:15:08 - たろちゃん 　いつも勉強させていただいております。 　タンパク質の取り扱いについて非常に初心者で、実験で行き詰っております。どなたかご教示いただけるとありがたいです。 　ある酵素を動物細胞で強制発現させて、細胞から抽出してその酵素活性を調べております。 　 　細胞はTris buffer内で超音波にて処理して、その上清を酵素反応に使っております。positive controlとしてその酵素のisotypeでは問題なく、酵素活性が出ますが、目的の酵素では全く反応がでません。Transfectionした細胞を免疫染色すると、その酵素は発現しておりますが、どうも細胞膜周辺に局在しているようです。 　成書で調べていると、膜タンパクや膜表在タンパクは可溶化するとのことですが、可溶化しないと酵素は働かないのでしょうか？その機所などもご存知でしたらお願いします。 あとおすすめの方法（塩や界面活性剤）などありましたら教えてください。 酵素活性は吸光度を測定しているので、それに影響を及ぼさず、変性をおこしにくいものなどお願いします。

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