全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.204-9 - 2011/03/28 (月) 15:24:01 - ~ たんぱく質を分けたいのであれば、 おお さんの挙げたイオン交換の他にも 逆相 ハイドロキシアパタイト アフィニティー などのカラムで分離が可能な場合があります。 作って終わりではなく、精製して何かに使う目的で発現させているのであれば、 精製工程の開発をしてもいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.204-8 - 2011/03/28 (月) 14:44:19 - おお 本気で除くなら条件をちゃんと調べないと行けないですけどイオン交換などのカラムは選択肢であることはいえると思います。 どちらかがくっついて、もう一方がくっつかない条件を見つけないといけませんけど。

(無題) 削除/引用 No.204-7 - 2011/03/28 (月) 10:41:00 - こむ 皆さま、色々とアドバイスありがとうございます。 ソニケーションなどタンパク質を抽出する方法はあるのですが、 本実験では、どうしても菌体を酵素処理（リゾチーム使用）したく、リゾチームを除去するしかないと思い、いいアイデアはないかと質問させていただきました。 2次抗体が交叉してしましまっている可能性は、あまり考えていませんでした。むしろ1次抗体がリゾチームと反応しているのかなと思っていました。（モノクロなのにおかしいと思ったのですが） 1次抗体処理せずに2次抗体のみでバンドが検出されるかどうか試してみます。 皆さま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.204-6 - 2011/03/27 (日) 22:07:19 - Actias 言われてみて、自分のノートを見返しましたら、確かにシグナルがあります。 ぼくは、BioRad のSDS-PAGE 分子量スタンダードを使っていて、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. の抗マウスIgG-HRPを使ってECLしてますけど、確かに、マーカーレーンにシグナルが出てます。 リゾチーム単独で泳動、メンブレンへの転写、２次抗体のみと反応、とやって、交叉しない２次抗体の反応液とする、というのは有効でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.204-5 - 2011/03/26 (土) 15:45:45 - おお 細菌には詳しくありませんし、ピンキリでしょうけど、大腸菌であればSDSを含むバッファーでプラスミドも出て来るわけですから、タンパクはほぼ溶出できると思います。直接菌を回収しSDSサンプルバッファーでボイルすれば大丈夫です。 また非変性状態で抽出したいなら、ビートビーターやフレンチプレスを使えばリゾチームなど酵素を使わずタンパク質を溶出する事ができると思います。両者とも酵母の硬い細胞へきを壊してタンパク質などを抽出するのに使われます。そういう装置がなければ、グラスビーズをほりこんでボルテックスで念入りに混ぜるという方法があります。この方法もちゃんとやれば酵母からタンパク質がとれます。 ネガコンが欲しいところですね。 ポリクロなら抗体をお使いのリゾチームで吸収して、特異性を得るというのもあり得る方法です。あフィ二ティーのカラムを使うのがオーソドックスなやり方ですが、リゾチームだけをSDSPAGEや、ドットブロットなどでメンブレンに吸着させそれを１次抗体溶液(ウエスタンに使う)にしたして、リゾチームにしん和性のある抗体だけ吸着してしまうような簡易な方法もとれます。 あ、ごめんなさい。モノクロってかいていた。。。 加えて、酵素自体違う生物種のものが利用できるならそういう物で交差性がないか確認してみるのもてかと思います。Endolysinとかファージ由来のものとかいろいろ選択肢はあるんではないかと思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.204-4 - 2011/03/26 (土) 14:41:14 - Boston-Pullman 非特異的に結合してしまう抗体であれば、リゾチーム無しのサンプルで検出されたバンドがものであると言い切るのは無理があります。 リゾチームを除く努力では無く、存在しても特異的に検出できる系、条件を見つけるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.204-3 - 2011/03/25 (金) 23:35:55 - こうじ 破砕方法を変えて確認してみるとかは実験に合いませんか？ 超音波処理、凍結融解、菌体のままSDSサンプルバッファーで変性など。 あとは電気泳動の方法を変えることでしょうか。 非還元（-DTTや-2ME）で泳動したり、MES-TrisやTricineにしたり グラジエントや均一ゲルの条件を変えたり、グリセロールや尿素入れたり。 リゾチーム自体はかなりの塩基性タンパクなので 目的のタンパク質のpI次第ですが、CMなど陽イオン交換カラムで 除去するなどの方法で対処できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.204-2 - 2011/03/25 (金) 21:42:14 - ami（偽物） >リゾチーム単独をウェスタンすると、なぜかモノクロの抗体に反応し、バンドが検出されます。 ２次抗体が反応してしまってるという可能性は？ まあ判別付けるためには２次元電気泳動とかですかね。

ウェスタンブロッティングの酵素除去方法 削除/引用 No.204-1 - 2011/03/25 (金) 20:49:03 - こむ 細菌を酵素処理（リゾチーム）してタンパク質を抽出、電気泳動し、ウェスタンブロッティングを行っています。しかしながら検出したいタンパク質とリゾチームの分子量が近いため、検出したものがリゾチームなのかそれともターゲットのタンパク質なのか判定がつけられません。リゾチーム単独をウェスタンすると、なぜかモノクロの抗体に反応し、バンドが検出されます。電気泳動する前のサンプルからリゾチームを除去する方法などありますでしょうか？ なお、ターゲットにしているタンパク質は組み換えタンパク質ではなく、菌体由来の物質です。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---