全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.199-6 - 2011/03/25 (金) 04:32:03 - Edo 皆さんありがとうございます。 もう一つPPAR aplhaのバンドを載せている論文を見つけたのですが、それはcell lysateで100ugアプライしているようでした。qqさんのおっしゃるように発現量が少ないためかなりの量をアプライしているのでしょうか。それと、Ponceau's red stainingでタンパク量が等しいことを確認したという記載があるのですが、これはタンパク量が多すぎてactinやtubulinのシグナルが強く出過ぎてしまうからでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.199-5 - 2011/03/24 (木) 16:36:16 - qq PPARaは比較的組織特異性の高い転写因子です。心臓での発現量が極めて低い可能性があります。 BATやLiverをコントロールにとることで、測定系が働いているのか明らかにできると思います。

(無題) 削除/引用 No.199-4 - 2011/03/24 (木) 16:14:34 - TS 読ませて頂く限り、論文などを参考に手法を決められているようですので、 手法に関する意見ではありませんが。 購入しているPPAR-alpha抗体メーカーでポジコンのLysateは売ってないのですか？　それでバンドが見えれば、手法、手技を疑えばよいと思うのですが。 ２つの抗体を試しているようですので、どちらかといえば手法に問題がありそうですが、一方で、ポジコンのタンパク質のバンドが検出できていると言うことなので、疑うべき可能性を１つ消しておくのも手かもしれません。 抗体のせいかも。。。手法のせいかも。。。と２つの可能性が残っていると解決が遅れると思います。

(無題) 削除/引用 No.199-3 - 2011/03/24 (木) 15:12:07 - Edo Boston-Pullman様、ありがとうございます。 ERR alphaでは細胞質タンパクでは全くバンドを認めず、核タンパクで綺麗にバンドが出たので核タンパクの抽出は問題ないのかなと考えていたのですが、PPAR alphaやLaminでバンドが出ないので悩んでいます。 一度分画せずにトライしてみようかと思います。 ただPPAR alphaは核タンパクを抽出しないと難しいと聞いたので核タンパク抽出にトライしてみました。しかし、よくよく聞くと核タンパクでも難しそうで、論文を色々見てもあまり綺麗なバンドが出ている論文を見つけられないので、何かアドバイスを頂けたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.199-2 - 2011/03/24 (木) 13:16:32 - Boston-Pullman 抽出を疑っているのであれば、まず分画しないでWBするのが良いかと思います。

ウェスタンでのPPAR alphaの検出について 削除/引用 No.199-1 - 2011/03/24 (木) 12:03:34 - Edo いつも勉強させていただいています。 今回、初めて核タンパクの抽出を行いウェスタンでPPAR alphaの発現を見ようと思っています。使っている組織は、心臓を液体窒素で凍結させてpowderにした物を使っています。 核タンパクの抽出は、10mM HEPES pH7.9, 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 0.5mM DTT and 1:1000 protease inhibitorのバッファーでホモジナイズし、その後、800g, 10minで遠心。上清をcytoplasmのタンパクとして抽出。ペレに、20mM HEPES, 25% glycerol, 0.42M NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.5mM DTT, 0.5mM PMSF and 1:1000 protease inhibitorのバッファーを加え、撹拌し、15分程度揺らした後に、14,000, 5minで遠心し、上清を核タンパクとして抽出しました。上記過程は、on ice、あるいは、4℃で行っています。 その後、細胞質と核のタンパクをそれぞれ15ugと30ug、gelで流し、トランスファーを行いました。 ERR alphaの発現を調べたら、細胞質では全くバンドが認めませんでしたが、核タンパクではシングルバンドが綺麗に検出されました。しかし、PPAR alphaは非特異的バンドだらけで、認めるはずのM.W.52kDa辺りにバンドを認めますが、それがPPAR alphaとは断言できるようなものではありませんでした。 ERR alphaの結果が綺麗なので、核タンパクの抽出は問題ないかと考え、ラボにある、PPAR alphaの抗体、abcam 1:1000, Sigma 1:1500, Affinity Bio Reagent 1:1000を使いましたが、いずれも非特異的バンドだらけでした。ちなみにコントロールとして使おうと考えているLamin(cell signaling)も上手くいきませんでした。 心筋細胞でPPAR alphaを見られている方でお薦めの抗体などはありますでしょうか。また、上記の私の方法で間違っている所はありますか？ 根本的にERR alphaが核タンパク(と思っている)でのみ認められたので、抽出は問題ないと考えたのですが、抽出からできていないのでしょうか。 何かご意見をお伺いできたらと投稿させていただきました。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---