BioTechnicalフォーラム [非特異吸着の低いIP用ビーズ]

非特異吸着の低いIP用ビーズ

No.198-TOPIC - 2011/03/24 (木) 05:00:31 - あ

二つのタンパク質の結合を調べるために、Flagタグタンパク質とその推定結合タンパク質を293にトランスフェクションし、Flagタグ抗体でIPして結合タンパク質が共沈降するか、Flag抗体と結合タンパク質に対する抗体でウエスタンブロットして調べています。

シグマのM2抗体を共有結合させたEZ-view Flagビーズを使っていますが、Flagタグタンパク質を発現させなくても、推定結合タンパク質がビーズに結合してしまいます。非特異吸着のためかと思い、吸着の少ないビーズを探しています。おすすめのビーズがあったら教えてもらえませんか？

プレクリアはしています。なぜか。EZ-view 抗HAビーズだと吸着しません。
　

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No.198-6 - 2011/03/26 (土) 04:02:18 - ABZO

以下は自分の経験に基づくあくまで私見ですが

1. プレクリア：　ヤレヤレってよくマニュアル本とかに書いてあるけどあんまり有効性感じない。
2. セファロース／アガロース担体：　なんか結構いろんなものがつく気がする。
3. 磁気ビーズ：　吸着低いというより、あれって磁石で壁にくっつけるから、遠心なしで回収できるので、遠心による微細な不溶物の持ち込みが低くなるからではないだろうかと思ってるがどうかな。
4. 塩濃度上げる：バックグランドがかなり劇的に変わることあった。上げるなら0.5~1Mの
範囲くらいかな。
5.界面活性剤：期待するほど劇的な変化はなかった。でも抜きでやるほど勇気ないので入れてる。たしか他のトピックで、「界面活性剤なしでIPやったらむしろバック下がってうまくできました」みたいのがあったはず。目的が蛋白質が界面活性剤なしても可溶化できるならば、相互作用に影響を与えないという上でもむしろその方がいいかもしれない。
6.SILAC法を使う。安定同位体アミノ酸ラベル法、最近はやり。LC-MS/MSでバックグラウンドか本物かを識別できる。精製度があまり高くなくてもできるのが利点。必要な培地とかアミノ酸とか一式キット化されたものも売ってるよ。

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No.198-5 - 2011/03/24 (木) 08:22:22 - あ

ありがとうございます。HAタグを作ってみます。

追加

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No.198-4 - 2011/03/24 (木) 05:59:01 - Boston-Pullman

すでに両遺伝子とも手元にあるようなので、時間があればFRET用コンストラクトもあるとデータの質が上がるかと思います。

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No.198-3 - 2011/03/24 (木) 05:55:37 - Boston-Pullman

おおさんのコメントとかぶりますが、その推定結合タンパク質をHAタグにして、EZ-view 抗HAビーズにてFLAGタンパク質を共沈するのはどうでしょうか？ビーズを捜して、再度条件検討するよりも確実で早いと思います。

(無題)

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No.198-2 - 2011/03/24 (木) 05:10:58 - おお

磁気ビーズなどは低吸着だと一般的な売り文句としてあるようですが、それでも吸着するものは吸着する様です。IPで落としてくるタンパクを逆にすれば場合によっては解決するかもしれません。

あとはちょっと厳しい条件で洗うか、、、どうも直接ビーズにという感じでもないので抗体が若干のしんわ性を持っているようなきがします。塩濃度を若干上げてみるとかLiClを使って洗うみたいなことがよくやられます。またデタージェントの工夫も有効かもしれませんが、ちょっと勇気がいるかもしれません。

非特異吸着の低いIP用ビーズ

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No.198-1 - 2011/03/24 (木) 05:00:31 - あ

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