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3kDaくらいのペプチドの電気えいどう トピック削除
No.195-TOPIC - 2011/03/23 (水) 03:43:49 - おお
TRIS-TRICINEなど短いペプチドを見るシステムが、いろいろありますが例えばwhole cell lysatesのようなクルードな系、組織のホモジネートとかで低分子領域がどの程度の分解能が期待できますでしょうか。

具体的な私のけいの相談というより、皆様の経験などお聞かせいただくとうれしいです。
　
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No.195-6 - 2011/03/24 (木) 06:22:51 - 朝一番
短いポリペプチドでも親水性分子ならネイティブ電気泳動で割ときれいなバンドがでます。ターゲットのｐＩが予測できれば適当なバッファで、未知なら高ｐＨまたは低ｐＨバッファのいずれかで、電気泳動できるはずです。分子サイズ情報の取得は大変ですが、４０年以上前のローテクを駆使すれば不可能ではありません。

(無題) 削除/引用
No.195-5 - 2011/03/24 (木) 01:29:28 - おお
皆さんありがとうございました。

今のところ分子量の正確性は期待していません。その領域でバンドがシャープに出るかどうかということです。

オリジナルのメソッドはミトコンドリアやようりょくタイの電子伝達系などのペプチドで応用されています。3kDaあたりまでは若干バンドがカマボコ型になるのですが分離は良好なようです。

ではトータルのライセートや違うソースから取ったサンプルでその領域がどうかというのが質問の意図です。あるいはあまり芳しくないので若干工夫をこらしたとかいう話があればうれしいです。

BPBは先端を流れないのはオリジナルの文献にあります。CBBをつかう(オリジナルの文献ではなんかフルカの違う色素名のものを使ってたと思いますが)とそれは解決するとおもいます。

厳しいですね 削除/引用
No.195-4 - 2011/03/24 (木) 00:26:37 - 葉
こちらの掲示板や、Nature protなど参考にトライしましたが、
（Tris-tricine/Ureaなど）
５kDa以下はうまく行きませんでした。5-10kDaはそこそこ見えるのですが。

プレキャストゲル（15-20%とか）で一応見て（あんまり見えてませんが）、
MSにかけてしまってます。

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No.195-3 - 2011/03/24 (木) 00:18:27 - yyy
10%Bis-Tris gelとMES bufferの組み合わせで10−20残基強（プロテアーゼの消化産物なので）を流したことがありますが、10残基強だとバンドにならずにボワッとしたスポットになって、分子量も遥かに上の方に出ます。丁度、アガロースゲルでDNAを流した時に、BPBが少分子量なのに高い所に出るのと同じ仕組みだと思いますが。20残基強だと、バンドにはなりますが、みかけ分子量はかなり高めでしかも、ペプチドのとるコンフォメーションによって、同じ長さ・分子量のはずなのに見かけ分子量はバラバラになります。多分、ああいう状態で分解能がどうとかというのは意味がないような気がします。同じ物でもコンフォメーション次第で複数出たり、別の場所に出たりするわけですから。
Tris-Tricineだとそういうのが無くなるかは試してないのでわかりません。

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No.195-2 - 2011/03/23 (水) 22:25:44 - ABZO
というかもう分子量数千とかの大きさになるとアミノ酸組成とかSDSのつき加減とかの影響が強く出てきて分子量とうりにはならないこともけっこう多い。だから分子量と移動度の関係はあんまりあてにならないかもしれない。分子量7000のペプチドが5000より下に出たりとかときどきあるよ。まあ4000くらいが限度かな。分離が目的なら、こういうちいさいやつは電気泳動よりもむしろ C18の逆相HPLCとかの方が得意とする範疇だね。
昔、（いや、今でもやってるか？）ペプチドームとかペプチドミクスとかときどき聞いたけどそういう研究の論文みればどういう方法論をとっているかわかるかもね。

3kDaくらいのペプチドの電気えいどう 削除/引用
No.195-1 - 2011/03/23 (水) 03:43:49 - おお
TRIS-TRICINEなど短いペプチドを見るシステムが、いろいろありますが例えばwhole cell lysatesのようなクルードな系、組織のホモジネートとかで低分子領域がどの程度の分解能が期待できますでしょうか。

具体的な私のけいの相談というより、皆様の経験などお聞かせいただくとうれしいです。
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