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(無題) 削除/引用 No.192-12 - 2011/03/30 (水) 01:33:53 - 123 PI染色はおっしゃるように、膜が破れた細胞のDNAをエチブロみたいに染めることで死細胞を除去できます。 生存率がもれこみの直接的な原因ではないかもしれませんが、経験が浅ければ浅いほどやった方がいいような気がします。またプライマリーな細胞ならうまくとれた取れていないがわかりやすいですし。染色後放置している時間があれば死細胞は増えていきますし。ある特定の細胞が死にやすかったらデータはばらつきます。また、厳密にやればPIでも未分化な細胞と分化した細胞が分かれたりもします。 私は最後の洗浄液を抜いた後、PI溶液で細胞を懸濁して、フィルター通してから解析をしています。

(無題) 削除/引用 No.192-11 - 2011/03/29 (火) 15:06:03 - nyamo > PIで死細胞は除いていますか？ > PI染色はちゃんと細胞当たりの量は同じにして、もれこみはないようにしていますでしょうか？ 回答ありがとうございます！ 実はＰＩ染色というのを初めて聞きました。 死細胞と生細胞を染め分けて、 生細胞のみゲ―ティングして厳密に死細胞を 除く技術ということでいいんでしょうか？ 私は、ＦＡＣＳで細胞を流した時、 ＦＳとＳＳの画面で、リンパ球と思われる大きな 細胞集団のみをゲ―ティングして解析しています。 死細胞は、ＦＳだかＳＳだかが極大or極小 （すいません知識が適当で・・・）なので このゲ―ティングで生きているリンパ球のみ抽出できる、 つまり死細胞はのぞけると教わったのですが、 普通はＰＩ染色して除くものなんでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.192-9 - 2011/03/25 (金) 21:45:03 - 123 PIで死細胞は除いていますか？ PI染色はちゃんと細胞当たりの量は同じにして、もれこみはないようにしていますでしょうか？ 生存率で変なこと起こったりもする気がします。

(無題) 削除/引用 No.192-8 - 2011/03/24 (木) 14:54:46 - nyamo みなさんありがとうございます。 > 最初の設定は、後日別のサンプルを解析する際の補正値の参考程度にはなると思いますが、実際には各実験ごとに設定をし直す方がいいと思います。 > さらに、Primaryに取ってきた細胞と、数日培養した細胞は大きさも、自家蛍光も変わっている可能性がありますので、やはり培養後の細胞をFACS取る時には新たに設定をし直す方が無難でしょう。 なるほど。ありがとうございます。 その日ごとに、一定の基準を設けて（例えば単染色サンプルを流して 細胞集団が９９％おさまるようになど）その基準通りに コンペ、リージョンなどを設定して 測定を行うということでよいのでしょうか？ 今後、培養後の細胞を測定するときは、同じ条件で培養した 細胞を使って設定します。 > 培養というのは具体的にどうやったんですか。増殖刺激を入れたのであれば細胞の大きさも、遺伝子発現もかわるのですから、刺激なしの細胞で設定したパラメーターでうまく行くと考えるのはあまりよろしくないと思います。 培養は増殖刺激をいれています。 確かに、考えていませんでしたが細胞の大きさなど いろいろ変わりますね。 私は、 増殖刺激をいれて培養した細胞と、入れないで培養した 細胞ではCD4,CD8のポピュレーションが変化するのですが、 （CD4+8+が増える） それが遺伝子導入によって変化が大きくなることを期待して （まあならないかもしれませんが）調べています。 今回は �@増殖刺激を入れて培養した細胞と入れないで培養した細胞 の間で、蛍光の漏れこみ度合いに差が出てしまった。 �A何個体か（遺伝子導入ラットのみ）測定したが、 　ある個体サンプルで設定した条件で 　別の個体サンプルを測定すると弱冠コンペが足りないorやりすぎ 　にみえる 　 という２点で悩みました。 助言の通り、培養後の細胞でその日の初めに設定するとして、 �@のようなことが起こった場合、 ・増殖刺激を入れた細胞を測定する条件　および ・入れない細胞を測定する条件　を作成して それぞれの条件で測定し、増殖刺激の添加によって変化があったのか 比べる　ということをしてもよいのでしょうか？ また、遺伝子導入したラットと普通のラットで条件を 変えて測定したデータを比べてもいいんでしょうか？ それともこのようなことが起こるのは単に私の手技の 問題なんでしょうか。 わかりずらい文ですいません！

(無題) 削除/引用 No.192-7 - 2011/03/24 (木) 13:17:11 - DC 最初にラットから細胞を調製してAb希釈倍率や感度・蛍光補正を設定しても、FACSのレーザーの状態などから全く同じ設定で後日全く同じ結果が出るとは限りません。 最初の設定は、後日別のサンプルを解析する際の補正値の参考程度にはなると思いますが、実際には各実験ごとに設定をし直す方がいいと思います。 さらに、Primaryに取ってきた細胞と、数日培養した細胞は大きさも、自家蛍光も変わっている可能性がありますので、やはり培養後の細胞をFACS取る時には新たに設定をし直す方が無難でしょう。

(無題) 削除/引用 No.192-6 - 2011/03/24 (木) 02:23:58 - Boston-Pullman FACSは素人なのですが、遺伝子導入によって自家蛍光が変わっている可能性はどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.192-5 - 2011/03/24 (木) 00:44:47 - TK-1 > 最初に設定したときは、とりたてのリンパ球を使用しましたが、 > その後測定したサンプルは、 > リンパ球を数日培養した後染色したものだったので > そのせいかなあ・・・とも思います。 > 同じ抗体・同じ細胞でも染まり方が変わるんでしょうか？ 培養というのは具体的にどうやったんですか。増殖刺激を入れたのであれば細胞の大きさも、遺伝子発現もかわるのですから、刺激なしの細胞で設定したパラメーターでうまく行くと考えるのはあまりよろしくないと思います。

(無題) 削除/引用 No.192-4 - 2011/03/23 (水) 17:27:09 - nyamo 回答ありがとうございます！ ネガコンはisotype-FITCとisotype-PEで 二重染色したものを使用しています。 メーカーも同じで、 「この抗体にはこちらのisotype抗体を」と 書かれていたものを使用しているので 問題ないかと思われます。 > 基本的には同じ感度・コンペンセーション値で測定するのがセオリーだと思います。 やはりそうですか・・・。 一度、普通のラットからリンパ球を採材し、 抗体の濃度決定をし、感度・コンペ調整・ リージョンも設定して それで問題ないかと思っていたのですが、 先日サンプルを測定したところ、 見た目であきらかにわかるほど、 細胞集団がずれてしまいました。 ４個体からとってきたサンプルを測定したのですが、 全てFITC単染色、PE単染色とも シングルポジティブの細胞集団が、 ダブルポジティブの領域にずれこんでおり、 やむなくネガコンの結果からリージョンを設定しなおし、 感度をいじるのは怖かったので、 コンペだけかけなおしました。 最初に設定したときは、とりたてのリンパ球を使用しましたが、 その後測定したサンプルは、 リンパ球を数日培養した後染色したものだったので そのせいかなあ・・・とも思います。 同じ抗体・同じ細胞でも染まり方が変わるんでしょうか？ フローサイトメトリーは全く初心者なので、 こんな調子でやるたび結果が変わったらどうしよう ・・・と恐々です。

(無題) 削除/引用 No.192-2 - 2011/03/23 (水) 16:10:39 - きよっち 基本的には同じ感度・コンペンセーション値で測定するのがセオリーだと思います。 FITCとPEで二重染色した場合、 FL1の蛍光強度の数%をFL2の蛍光強度から引いていますので、 同じ条件で染色している場合、漏れこみ率が変わってくる事はありません。 ネガティブコントロールには何を使用していますか？ Isotypeは？　同じメーカーですか？ メーカーが違えば抗体あたりの蛍光色素の付着数が違ったりしますよ。 適切にネガティブコントロールを取って、 コンペンセーション以前に綺麗に感度を合わせる事が重要かと思います。 その後、それぞれの単染色したサンプルを流し、コンペンセーション値を合わせると綺麗なデータが出ると思います。

ＦＡＣＳのコンペンセーションについて 削除/引用 No.192-1 - 2011/03/22 (火) 13:42:48 - nyamo ＦＡＣＳのコンペンセーションについて 質問します。 私は、遺伝子導入したラットと、普通の（導入していない） ラットのリンパ節を採取し、 ＣＤ４-FITC抗体とＣＤ８-PE抗体で染色して、 各細胞分画（CD4+8+,CD4+8-,CD4-8+,CD4-8-）の 割合を比較するという実験をしています。 このような場合、遺伝子導入したラットと 普通のラットにおいて、違うコンペンセーション条件 で測定してもよいのでしょうか？ あるいは、遺伝子導入ラットを何匹か測定する時に 個体ごとに違うコンペンセーション条件で 測定してもよいのでしょうか？ 単染色サンプルを測定してから、蛍光のもれこみが ある場合はコンペ設定し、 ２カラー染色のサンプルを測定しているのですが、 個体によって蛍光のもれこみ度合いに ばらつきがでます。 コンペの強さが、各細胞分画の割合（つまり結果）に ダイレクトに影響するので、どうしたものか困っています。 また、現在 ネガティブサンプル測定→リージョン設定（99％程度おさまるように） →各単染色測定→コンペ設定（もれこみが1％程度になるように） →2カラー染色サンプル測定 とやっていますが、何か問題はあるでしょうか？

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