みなさま
大変多くのアドバイスをいただき本当に、感激しております><。
色々試行錯誤していたのですが、手持ちのリコンビナントも底を付きそうで、手詰まりを感じていました。
が、手詰まりどころかまだまだ沢山の改善の余地があることをみなさまから教えていただきました。
まだまだ自分は未熟だなと考え改めた次第です><。
>Boston-Pullmanさま
>カルシウムイオンとのアフィニティーは強いのでしょうか？泳動に使用しているバッファーの組成に>もよるかと思いますが、イオンが泳動中に解離してしまうとか。EGTAは入っていませんよね。
affinityは具体的な数字としては算出されていないと思います。
ただ、このnative PAGEの実験系は以前に論文として報告されているやり方を踏襲したものですのでうまくいくはず、と思っていますが、完全に同じやり方か？と言われると論文に詳しく書かれてないというのもあり、確信が持てません><。EGTAなどキレーターは入ってはおりません。
>思い切って泳動前に２量体を架橋するのはどうでしょうか。それならば手馴れたSDS-PAGE/WBで解>析できます。
非常に斬新で私にとって盲点でした。
架橋することは具体的にどうすればよろしいのでしょうか？
ぜひその詳細なプロトコルをご教示いただけますと幸いです。
私は0.5 ugのリコンビナント精製蛋白をtotal 10 ulの系でCa++ or 他の二価イオンと4 hr, 37℃で反応させ、2x sample buffer (SDS-) 10 ulを加え優しくpipattingした後、自作のnative Gelにapplyしております。
泳動条件は
C.V 100 Vで、この時17.5 mAをしめしています。
泳動bufferはTris-Glycine系（SDS-）です。
架橋というのは、2xsample bufferを加える際に架橋剤を加える、ということでしょうか？
架橋剤というとアルデヒド系を思い浮かべますが、これは本当は二量体化していない分子同士も距離が近ければ架橋してしまう、ということはないのでしょうか？
勉強不足で申し訳ありません。
是非プロトコルと、その使用感想等、併せて教えていただけますと幸いです。
>分離ゲル作製時に使う水飽和ブタノールで対処できませんか？
確かに、これを是非その隙間に入れてみようかと思います。ありがとうございます。 |
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