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(無題) 削除/引用 No.187-5 - 2011/03/24 (木) 17:12:47 - ship ご返信遅れて申し訳ありません。 waka先生御教授ありがとうございます。 >血管内腔をmediumを注入して押し出した後、遠心されてるんですか？ 血管内腔をmediumを注入して押し出した後遠心していました。確かに直接Type1-Col coated plateに入れる方法は当然問題ないですし試していきたいと考えております。ご指摘ありがとうございます。 >この場合のECの定義は何ででしょうか？またどう確認されておりますか？ 申し訳ありません。まだ，細胞がうまく培養できていない状態ですので，今後培養できた場合確認作業などを行っていきたいと考えております。 　また，EC専用のgrowth factor（100 ug/ml, endothelial cell growth supplement from BD biosciences）は今後試していきます。 御教授ありがとうございます。今後とも宜しくお願いします。 御教授ありがとうございました。今後とも宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.187-4 - 2011/03/22 (火) 22:45:12 - waka >その後，24Gゲージのカニューレを挿入し反対側は糸で縛り，コラゲナーゼタイプ�Uで満たして45分間37度にインキュベートし，5mlのDMEMに還流しております。そして，遠心してコラゲナーゼ�Tでコートされたディッシュで2時間置き洗っています。 血管内腔をmediumを注入して押し出した後、遠心されてるんですか？ 私は遠心せず、適当な培地に希釈し、そのままType1-Col coated plateに2 hrs静置後、上清吸引除去して培地を加えています。 >しかしまだ内皮細胞の摘出には至っておりません。細胞自体うまく採れていないようです。 この場合のECの定義は何ででしょうか？またどう確認されておりますか？ 私の場合、paltingして2wks後にPECAM-1/CD31の発現をFACSで見ますとほぼ100 % positiveです。 また別の実験で、血管の内腔をmediumで押し出した後、遠心してその細胞をいきなりFACSに供したことがあります。そうすると、CD31陽性細胞は25-30 %程度いるようでした。やり方は基本的にはshipさんと同じです。 ちなみに、ECがcontaminantsに比べdominantに増えるように、EC専用のgrowth factorを使用しています。（100 ug/ml, endothelial cell growth supplement from BD biosciences）

(無題) 削除/引用 No.187-3 - 2011/03/22 (火) 15:40:03 - ship SC先生御教授ありがとうございます。 10mL/5秒程度。自分は5ml/5分程度とかなりゆっくり注入してました。まずはそれを改善させてみます。 ただSC先生のお話を聞きますと，内皮がとれたとしてもコンタミに苦労しそうですね。大動脈全体をコラゲナーゼ処理してplatingし、繊維芽細胞と平滑筋をD-valineとheparinでeliminationする方法についても勉強してみます。 御教授ありがとうございました。今後とも宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.187-2 - 2011/03/22 (火) 08:18:48 - SC 　私も以前にこの方法（某国内誌掲載のプロトコールと推察します）を試しましたがうまくいきませんでした。ただ、うまくいかなかったのは他種細胞のコンタミのためで、ECそのものは確かにとれていたように思います。 　ship様のプロトコールと大差ないのですが、ECを洗い出すときに10mL前後のmediumを割と勢いよく（10mL/5秒程度？）注入していました。 　最近では大動脈全体をコラゲナーゼ処理してplatingし、繊維芽細胞と平滑筋をD-valineとheparinでeliminationする方法を取っています。成功率50%程度なので、現在改良中です。 　ship様のプロトコールを用いた論文も出ているので、何かしらのコツがありそうですよね。私も興味あるところです。 　参考にならずすみません。

マウス大動脈から内皮細胞の摘出 削除/引用 No.187-1 - 2011/03/21 (月) 14:02:58 - ship 誠お忙しいところ申し訳ありませんが御教授の程宜しくお願いします。 マウス大動脈を摘出し酵素処理して内皮細胞を取り出したいと考えておりますが，うまく内皮細胞の採取に至っていません。 胃や腸、肝といった内臓を摘出した後左心室からPBS/Heparinを還流し、その後、ピンセットを大動脈と脊柱との間に差し込み、ずるずると下方へスライドさせ、胸部大動脈の摘出しております。肋間動脈などもあり漏れは若干ありますがしっかり膨らんでおります。 その後，24Gゲージのカニューレを挿入し反対側は糸で縛り，コラゲナーゼタイプ�Uで満たして45分間37度にインキュベートし，5mlのDMEMに還流しております。そして，遠心してコラゲナーゼ�Tでコートされたディッシュで2時間置き洗っています。 しかしまだ内皮細胞の摘出には至っておりません。細胞自体うまく採れていないようです。 その他，若干の漏れを利用し，37度で加温しつつ45分間コラゲナーゼタイプ�Uを45分かけ2mlほどゆっくり注入も試してみましたがうまくいきませんでした。 なにか内皮細胞を採取する工夫などありましたら御教授の程宜しくお願いします。

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