すみません、3日前に投稿したのですが、トピ名を途中で送信してしまいました。スクリプトによる投稿に見えたかもしれません。暗証番号を入れていないので削除できず、申し訳ありませんがもう一度投稿させてください。
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E9.5マウス胚のprimordial germ cell（PGC)をALP染色で同定（そして可能ならカウント）しようとしています。
とても古典的な方法だと思うのですが、これまでしたことがなく今回はじめて以下のように行いました。
E9,5の胚を取り出し、yolk sacを除く
頭部(胚全体の1/3くらい）を取り除く（genotype)
残り2/3を4%PFA in PBSで固定 4C over night
PBSで2回洗浄
内因性ALP活性の不活化のためPBS 70-75C 15分
室温のPBSで冷ます
AP buffer (100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM Nacl, 10mM MgCl2) 室温 10分
BM purple AP substarte (Roche 1442074) 4C over night
PBS (+ 2mM MgCl2, 0.1% Tween-20) で洗浄（シェーカーでゆらしながら）
70% エタノール 4C で保存
参考にしたプロトールはManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual（版はわからない）です。
この後顕微鏡下で胚を見てみましたが、正直染まっているのかいないのか
はっきりいってよくわかりませんでした。（何も染まっていないように見えた。）
そこでお聞きしたいのは、
１ プロトコールがよくなくて染まっていないのか？ 手順に改善すべきところはあるでしょうか。ちなみに何をポジコンにしたらいいのかよくわからなかったので、とりあえず内因性ALP活性の不活化操作なしの胚を並行して染色したところ真っ青になりましたので、AP substrateなどの試薬は問題ないと思います。
２ 実は染まっているけれど観察方法がよくないのか？ 今回は、染色後whole mount？の状態で胚をころころころがしながら顕微鏡で見ただけです。これだと体表しか観察できていないということになるでしょうか。この時期のPGCはmigrationの真っ最中だと思いますが、ある程度胚を加工（切り出す？）して観察する必要があるのでしょうか？ だとすればどのように？
３ トラブルシューティングとはちょっと違いますが、染色操作中みなさんはどんな容器を使用されていますか？ 私は今回12-well plateを使いましたが、ALP不活化の時だけはEppen tubeにうつしてヒートブロックで温めました。でもチューブに入れると操作しにくい（出し入れするときに胚を壊してしまいそうな）のでできればさけたいなぁと。また、染色後にはplate内に沈んだ状態で観察しましたが、スライドグラスなどにのせたほうがよかったでしょうか（カバーグラスも必要？）
経験者の方のご意見いただければ幸いです。
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