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(無題) 削除/引用 No.156-10 - 2011/03/16 (水) 23:46:42 - Edo 中年様、前回の私の書き込み時とほぼ同時にご回答をいただいていたようで読むのが遅くなり申し訳ございません。 精製は、"Antibodies are purified by protein A and peptide affinity chromatography."と書いてあります。 これは、protein Aをリガンドタンパク質としてクロマトグラフィーで精製したということでしょうか。 2 O/Nは以前の書き込みでバンドが綺麗になると書かれている方がいたので、単純に時間をかけてゆっくりとしたら良いのか程度にしか考えず試してしまいました。おおさんは、O/Nでも最近は避けておられるそうなので私も、もちろん抗体次第ですが、避けるようにしようかと思っています。ただ、O/Nは次の日の実験が早く進められるのでありがたい面もあるのですが。 20ugは培養細胞ではなく、心臓の組織をすりつぶしてpowderにしたものからタンパクを抽出しています。

(無題) 削除/引用 No.156-9 - 2011/03/16 (水) 15:59:53 - Boston-Pullman 20 ug が過剰だとは思いませんが、5 ug、10 ug が培養細胞では平均的でしょうか。室温１時間ほどでノンスペも無く検出できるのであれば、その条件で進めるのが良いと思います。結果を早く知りたいですし。 サンプルが貴重なのであれば、アプライ量を検討する必要がありますが、今の条件で再現性が取れるのであれば、綺麗なデータが取れ次第、新たに発見した変化について私ならば研究を先に進めます。

(無題) 削除/引用 No.156-8 - 2011/03/16 (水) 14:58:47 - Edo Boston-Pullman様、大変勉強になりました、ありがとうございました。 ご指摘のようにバンドシフトはなくシングルバンドでした。 ちなみにアプライした量は20ugで、言われるように多かったと思います。 アクチンに関しては、それまで3回ほど別の抗体反応をさせていたからか、バンドの強度は濃すぎることなく出ました。

(無題) 削除/引用 No.156-7 - 2011/03/16 (水) 14:51:42 - 中年 エピトープが必ずしも常に露出しているとは限らない免疫沈降においてなら、長時間のインキュベーションで結果が改善するということもあるかもしれませんが、ウエスタンにおいて2 overnightのインキュベーションとは、百害あって一利無しであるように私には思えます。 抗体はポリクロとのことですが、どの程度の精製度のものをお使いですか。抗血清でしょうか、IgG画分でしょうか、抗原でアフィニティー精製されているのでしょうか。精製度が低いほど予期しないアーティファクトが起こる可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.156-6 - 2011/03/16 (水) 14:05:31 - Boston-Pullman リン酸化はアフィニティー変化を引き起こす例えです。 人によってはリン酸化イコールバンドシフトと考えています。 バンドシフトが実際起きていれば、２サンプル間の違いに気付くはずです。 トピ主さんは特記していなかったのでシフトはなかったものと思います。 それでもどちらかのサンプルでリン酸化が優位に起こっている場合があって、それが原因で反応速度が変化しうる可能性をふれただけです。 ただポリクロとの事なので、一カ所の修飾でドラマティックに変化するかは抗体によります。 あと、そこまで強いシグナルなのであれば、葉さんがご指摘のようにアプライするサンプル量を減らすのはファーストチョイスです。そもそもそんな量ではアクチン抗体によるnormalizationも出来ていないでしょうね。

ありがとうございます 削除/引用 No.156-5 - 2011/03/16 (水) 13:33:33 - Edo 皆様早速の回答ありがとうございます。 シグナルの強度の違いというのは、長時間抗体反応させることによりアフィニティーの弱い抗原にまで結合するからという考えで良いでしょうか。 ちなみに抗体はポリクロで、短いexposureでも目に見えた差は出なかったです。(短いexposureというのがフィルムをメンブレンに手で押しつけているのですが、それでよろしいですか？) リン酸化のバンドシフトがこの現象に関わってくる可能性があるのでしょうか？すみません、よく理解できていなくて。

(無題) 削除/引用 No.156-4 - 2011/03/16 (水) 07:26:03 - おお 私もアフィニティーの違いと、シグナルの強度の違いの両方の可能性を考えます。オーバーナイトでシグナルが強く出たなら、フィルムの直線せいのレンジを超えてしまっているかもしれません。非常に短いexposureでどうかなど気になります。 抗原のアフィニティーのちがいもあると思いますし、抗体がポリクロなら抗体のそれぞれのクローンのアフィニティーも関係してくるかもしれません。 2 O/Nって長すぎるような気がします。場合によりますがO/Nでもシグナルは強くなりますが、私の場合はバック(ノンスペのバンド)も上がりますので最近は避けるようにしています。ノンスペが上がるというのは、アフィニティーの弱いものも長時間で結合するということですよね。 違いが見える系があるわけですから、次は差があることを裏付ける違う実験など総合的に見ていくといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.156-3 - 2011/03/16 (水) 06:38:53 - Boston-Pullman あえて別の可能性をあげるとすると、抗原の翻訳後修飾により抗体のアフィニティーが変化した。 室温でインキュベーションしたときは修飾のないタンパク質にすばやく結合し、修飾を受けたタンパク質を多く含むサンプルでは時間がかかるため、差が出てきたなど。 リン酸化で必ずバンドがシフトするとは限らないので。

その条件では。 削除/引用 No.156-2 - 2011/03/16 (水) 00:45:33 - 葉 一回目はシグナルが強すぎて差が出なかった（バックが低ければ相対的にバンドがきれいに検出） 二回目は、ストリッピングによりシグナルが下がり、差が出た。 という結果ではありませんか？ ウェスタンの再現性は、出そうと思えば出せますし、差を出せと言われれば出せます。 が、定量性はそれほどない（検出方法によるが）、と思います。 最適化するなら抗体濃度とアプライするタンパク濃度をふることのほうが、 抗体処理時間より重要だと思います。

ウェスタンのバンドの再現性について 削除/引用 No.156-1 - 2011/03/16 (水) 00:01:56 - Edo いつも勉強をさせていただいています。 過去のトピックを検索したのですが、見つけられないだけか見あたらず、質問をする人もいないぐらいのことなのかも知れませんが教えていただきたくてトピックを立てさせていただきました。 ウェスタンブロッティングの1次抗体の反応時間によるシグナルの差についてです。 このフォーラムで2 overnightで1次抗体を反応させるときれいなシグナルが得られることが多いという記載を見たので、今までしたことがなかったのですが、先日週末でもあったので2 overnightでしてみました。きれいなシグナルは得られたのですが、見た目に有意差のない結果でした。 期待した結果と違うので、もう一度同じメンブレンをstrippingをした後に、1時間で反応をさせたら期待したような見た目にも有意差のある結果でした。シグナルも普通に綺麗に検出をされました。 overnightや1時間という1次抗体の反応の時間の差で、結果が全く変わってしまうことはよくあるのでしょうか。

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