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ダイレクトシークエンスのトラブル トピック削除
No.141-TOPIC - 2011/03/09 (水) 22:53:59 - kich the leg　
cell lineのSNPについてreal-time PCRで検出後のPCR産物をforward primerを用いたダイレクトシークエンスを実施しました。
得られた結果を確認するとforward primerで読み終わりあたりからちょうどこの配列の相補的な配列がノイズのように読み込めていました。
配列長は160bpで方法は市販のスピンカラムで精製後、ABI社のBigDye Terminator V.3 でcycle sequenceし、エタノール精製後、フォルムアミド処理し測定に供しております。測定はABI 3100 Avantで実施しております。

シークエンスに使用しているprimerのコンタミを考え、再合成したものを使用したのですが、いずれのcell lineにおいても発生しており、解消されませんでした。real-time PCRはprimer pair 以外にTaqMan ProbeとPNAを入れた系で実施しております。

どなたかこのような経験時のトラブルシューティングの方法をご存知ありませんか？

どうぞよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.141-8 - 2011/03/10 (木) 00:52:55 - さて
セルフプライマーダイマーでは無いので、その件は忘れてください。

「forward primerで読み終わりあたりから」を、
「primer配列の直後」と読み間違えていました。

APさんの仰る通りだと思います。

AP様 削除/引用
No.141-7 - 2011/03/10 (木) 00:43:20 - kich+the+leg　
コメントいただきありがとうございます。

早速に電気泳動で精査してみます。

(無題) 削除/引用
No.141-6 - 2011/03/10 (木) 00:37:29 - AP
PCR産物の二量体（あるいはもっと多量体）ができているのでしょう。
プライマーから伸長が起こるのではなく、一本鎖に変性した鋳型の3'末端が、別の鋳型鎖にアニールして伸長が起こるとそういうことが生じます。PCR産物PCRの条件が良くないと（たとえばサイクル数の過剰、酵素の過剰など）、良くあることです。

PCR産物を電気泳動して、シングルバンドであることを確認してみましょう。余計な配列はノイズのように見えているということから、おそらく、正規の産物が主要なバンドとしてあるけれど、多量体のバンドもうっすら出ているのではないでしょうか。

そもそもそういう産物ができる条件では、real-time PCRの結果も適切ではないことになります。

さて　様 削除/引用
No.141-5 - 2011/03/10 (木) 00:33:57 - kich+the+leg　
ありがとうございます。

精製は反応液から直接実施しております。

セルフプライマーダイマーとしたらその場合の対応方法はどのようなことが考えられますか？（再デザインがもっとも望ましいでしょうが）
たとえば、95℃とかでヒートショックをかけるとかの有効性はありますか？

あと、現れた産物は正規の配列のあとにさらに160bpほどのまったく相補的な配列です。セルフプライマーダイマーでこのような大きさの産物が出現するのでしょうか？

初歩的な質問ばかりで恐縮です。

併せてご教示くださいますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.141-4 - 2011/03/10 (木) 00:32:51 - さて
セルフプライマーダイマーを作ってしまうプライマーの場合、
そのプライマーは、シークエンス反応に使えないという事を意味します。
（煮ても焼いても食えないってやつです。）

今、Forward primerをシークエンス反応に使って、
トラブルが起きているとの事ですので、

（解析対象のSNPの位置にもよりますが、）
Reverse primerをシークエンス反応に使ってみてはどうでしょうか。

それでもダメなら、再度プライマーを設計する必要がでてくると思います。

(無題) 削除/引用
No.141-2 - 2011/03/09 (水) 23:05:42 - さて
PNAを使ったことがないので、詳しくは分かりませんが、

単にforward primerによる、セルフプライマーダイマーではないでしょうか？

Real-time PCRのPCR産物の精製について「スピンカラムで精製」と書かれていますが、
PCR反応液から直接精製を行っているのか、
一度アガロールゲル電気泳動を行い、ゲルから切り出して精製しているのか、
どちらでしょうか？

あとは、Forward primerではなく、Reverse primerでシークエンスをかけてみるとか。

ダイレクトシークエンスのトラブル 削除/引用
No.141-1 - 2011/03/09 (水) 22:53:59 - kich the leg　
cell lineのSNPについてreal-time PCRで検出後のPCR産物をforward primerを用いたダイレクトシークエンスを実施しました。
得られた結果を確認するとforward primerで読み終わりあたりからちょうどこの配列の相補的な配列がノイズのように読み込めていました。
配列長は160bpで方法は市販のスピンカラムで精製後、ABI社のBigDye Terminator V.3 でcycle sequenceし、エタノール精製後、フォルムアミド処理し測定に供しております。測定はABI 3100 Avantで実施しております。

シークエンスに使用しているprimerのコンタミを考え、再合成したものを使用したのですが、いずれのcell lineにおいても発生しており、解消されませんでした。real-time PCRはprimer pair 以外にTaqMan ProbeとPNAを入れた系で実施しております。

どなたかこのような経験時のトラブルシューティングの方法をご存知ありませんか？

どうぞよろしくお願いいたします。
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