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(無題) 削除/引用 No.1397-7 - 2012/01/05 (木) 01:16:10 - kishi snow様 >１レーン当たりのアプライは４０μｇで行い、内部標準は蛍光が飽和するほど出ます。 と書いておられますが、目的とする蛋白がwhole cell lysate中に何%存在するかは分からないので、internal controlが飽和する程に検出されるという情報は、『ウェスタンで検出できない』という状況に関してはあまり意味がないかと思われます。 また、ウェスタンの転写に用いるメンブレンがセルロースなのかPVDFなのか分かりませんが、それぞれ蛋白の吸着能力にキャパシティーがあることは御存知でしょうか？いくらwhole lysateの濃度を濃くしても目的の蛋白が全て吸着されているとは限りません。むしろ濃くしすぎると、他の目的としない蛋白群がキャパを占めてしまう場合もあります。 ですので、前回の私の回答では目的蛋白を濃縮（および精製）してウェスタンを行う方法を提案してみた次第であります。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1397-6 - 2012/01/04 (水) 17:18:33 - 774 抗体にも依るかと思いますが、 FACSで細胞当たりの発現量を確認するのはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1397-5 - 2012/01/04 (水) 14:17:05 - snow 皆さまありがとうございます やはりＷＢでやるのが一番の近道のようですね。 抽出が上手く出来ていない、ということはありますでしょうか？ 抽出はwholeで行い、RIPAをペレットに加え、氷上で１０分静置という 方法で行っています。１レーン当たりのアプライは４０μｇで行い、 内部標準は蛍光が飽和するほど出ます。 違う抗体で試すことも考えなければいけませんね。

(無題) 削除/引用 No.1397-4 - 2012/01/04 (水) 09:18:58 - ~ >PCR＋免染のデータ RT-PCRだけであれば、既に突っ込まれている通りですが、免疫染色のデータも取れるのですよね。 免疫染色できれいに差が出るのであれば、WBで検出限界以下ということは無いと思うのですが。 使用している抗体がWB向けではなかったり、lysis bufferが膜貫通型タンパク質向けではなかったりはしませんか？

(無題) 削除/引用 No.1397-3 - 2012/01/04 (水) 07:48:13 - kishi ウェスタンの詳細が分からないので予想で回答させていただきますが、おそらくウェスタンに用いたライセートはWhole cell lysateなのでしょうか？ もし少量のリシスバッファーで溶解し、全てのライセートを1wellで使用されていらっしゃるのであれば私の回答は参考にならないと思われますが、数十マイクロリッターのバッファーで溶解し、wellに分注されているのであれば、目的とされる蛋白を免疫沈降などで濃縮して全て1wellに流すという方法もあるかと思います。ごく微量しか回収できない細胞では、私はよく行っております。もちろん抗体の質にも依存しますが。言い換えれば、検出したい蛋白を1ウェルにどのくらい流せるかという話になりますが、これはあくまでもウェスタンでどうしても検出したいという話題に対しての回答です。 その他の議論はカイさんの回答に強く同意します。 だいぶ一方的な回答内容となってしまい、失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.1397-2 - 2012/01/04 (水) 03:35:34 - カイ 私は「代替できない」に一票です。 が、たとえこのフォーラムで10人中9人が「代替できる」だったとしても、レビューアーが「やっぱりウェスタンはあったほうがいい」と言い出したら結局やらなきゃいけないんですよ。 別の雑誌に投稿して「代替OK」なレビューアーに当たるまで待つと言うなら別ですが。 代替できない理由。 1）半定量PCRはｍRNAの発現を見ているのであり、実際タンパク量が上がっているかどうかは示す必要がある。 2）染色はウェスタンと違いタンパク質の大きさによる選別がかからないため、なにが染まっているのが疑問。 2）の対策としてsiRNAをすれば染まらないとか、阻害ペプチドを入れるとかありますが。 あと染色の定量は同じ条件で写真を撮り、多数の細胞をそれぞれ定量して平均をとらないと、都合のいい写真一枚ずつだけ見せられてるんじゃないかと言われます。 意地悪な言い方をしてしまえば、「ウェスタンでうっすらしか見えない程度の発現量で、本当に大事な機能をしていると言えるの？」「ウェスタンでうっすらしか見えない程度の発現量なのに、染色できてるの？これちゃんとその標的が染まってる？」 などとも言われます。 抗体によってはウェスタンの感度が悪いが染色にはいい（その逆も）というのもありますから、他の抗体を使う、細胞を力技で増やすなどで解決したほうがいいと思います。 最終的に送ろうと思ってる雑誌のレベルによっても違いますから、ウェスタンは見せてないけど掲載されてる論文もあります。 細胞が微量しか取れない（初代培養もしくは培養して増やせない細胞）というのもわかりますが、だったら組織のサンプルでは？とか、遺伝子背景が同じ個体いくつか集めて取った細胞全部あわせれば量は増える？とかも言われうると思うし。

ウェスタンが上手くいかないときの代替法について 削除/引用 No.1397-1 - 2012/01/03 (火) 19:05:24 - snow いつもお世話になっております。 どうかお力をお貸しください。 現在、ある細胞（微量しか取れません）にあるホルモンを添加した時の 細胞膜に発現する１回膜貫通型受容体の発現量の変化を追いかけています。 このホルモンにより標的の受容体の発現量が上昇することを半定量PCRで突き止めました。 　 次にこのホルモンの受容体（標的とは別です）の下流を阻害剤で阻害し、 どの経路が標的の受容体の発現調節に関与しているのかを調べており、 WBで標的の受容体の発現量の変化を調べようとしているのですが、 受容体の発現量が低いためか、定量できるほどの濃さのバンドも得られず、 行き詰まっています。 そこで、この標的受容体の発現量の変動をPCR＋免染のデータで代替できないかと考えているのですが、皆さまのご意見を伺いたく思います。 何卒、お願いいたします。

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