全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.139-9 - 2011/03/17 (木) 22:27:36 - ABZO アセトンでやったときは、乾かしちゃうとものすごく溶けにくいよ。半乾きくらいになったら早めに可溶化バッハーいれたほうがいいよ。SDSは確かに変性作用は強力だけど意外と沈殿とかすのが苦手みたいだ。沈殿の中までなかなか浸透しにくい感じする。 そんなときは8M尿素が意外といける。もちろん十分な可溶化にはそれなりに時間はかかるけど。沈殿はチップの先で砕いてこまかくするといいよ。溶けるのが早まる。いったん少量の８M尿素で溶かしてからSDSとか加えるといいと思う。尿素はいったサンプルは加熱処理しないほうがいいよ。とくにプロテオーミクス的な解析するときは。 あと培地の分泌蛋白質の濃縮は硫安沈殿でやってる。

(無題) 削除/引用 No.139-8 - 2011/03/15 (火) 10:53:58 - のりー sonicationをかけると溶ける場合がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.139-7 - 2011/03/10 (木) 11:59:16 - ~ とりあえずは、沈殿の物性を調べるために、酸・アルカリ、ボイル等で溶ける条件を探してみてはいかがでしょうか。 タンパク質が主成分であるかは、溶かした後の吸光ピークで分かるのではないでしょうか。 また、イオン交換カラムは自作すれば安いですよね。 樹脂は500mLくらいで1万円を切るものもありますし、カラムは適当なガラス管でも注射器でも使えば作れます。 500mLのサンプルに4倍量のアセトンを加えているということは、1サンプルあたり2Lのアセトンを使用しているのですよね？アセトン2Lは安くても5千円はかかるのではないでしょうか。 サンプル数が多いというのであれば、使いまわせるカラム精製の方がコスト的にはいいのでは。

ありがとうございます 削除/引用 No.139-6 - 2011/03/10 (木) 10:31:54 - 雪 コメントありがとうございます。 >qq様 無血清培地単独のアセトン沈殿はしたことがありませんでした。 さっそく試してみようと思います。 >笑い男様 尿素とアルギニンですか… 調べてみたら効果ありそうですね！ ただ、予算の都合上来月でないと試薬が買えなさそうですが…　涙 >~様 イオン交換カラムがラボにないのです。。。 最初に、限外ろ過も検討したのですが、sample数と容量が多いので コスト的にアセトン沈殿を選んだのでした… 限外ろ過もちょっと試してみます。

(無題) 削除/引用 No.139-5 - 2011/03/10 (木) 10:30:05 - qq >~ >用いるタンパク質の選定が難しいと思いますが。 は、その通りだとおもいながら書いちゃったのだけど、 そもそも、 >>500mlほどの無血清培地を濃縮してSDS-PAGEにかけようと思っています。 （本当かいな？）なのですから、何にも考えなしでやる実験じゃあないでしょう？何か見つけたいものに考えがあってのことだとおもいますね。それなら、適当なタンパクがあるんじゃあないかなと思った次第です。 なんの考えもなければ、一定量の細胞でもいいかもしれないと思います。 まあ、それよりも「タンパクじゃああ無いんじゃない？」って思いが強いです。SDS＋Ureaは有りだなと思います。

溶かすだけなら塩酸グアニジンも使えるかも？ 削除/引用 No.139-4 - 2011/03/10 (木) 09:49:25 - ~ ラボの手持ちの機器次第ですが、沈殿させずにイオン交換カラム等で精製・濃縮してはいかがでしょうか。 他のタンパク質と分離できた後であれば、限外ろ過などでも濃縮できますよね。 >qq さん >定量的に回収できることを確認すれば 溶けないタンパク質の性質や立体構造なども関係があると思いますので、添加回収に用いるタンパク質の選定が難しいと思いますが。

思いつきで 削除/引用 No.139-3 - 2011/03/09 (水) 21:35:11 - 笑い男 尿素 アルギニン

(無題) 削除/引用 No.139-2 - 2011/03/09 (水) 19:49:10 - qq 培地に既知の濃度のタンパクを加えておいて、定量的に回収できることを確認すれば、良いのではないでしょうか。 溶け残りがタンパクでないかもしれませんよね。 少なくとも、無血清培地単独をアセトン沈殿して、再溶解できないものは認められないでしょうか？

アセトン沈殿後の再溶解 削除/引用 No.139-1 - 2011/03/09 (水) 18:57:24 - 雪 500mlほどの無血清培地を濃縮してSDS-PAGEにかけようと思っています。 培地に４倍量の冷アセトンを加え、-20℃のO/Nでタンパク質を沈殿させ、 遠心してペレットにし、SDS sample bufferを入れたのですが再溶解がうまくいきません。 ペレットの体積の半分くらいは溶けるのですが、どうしても溶け残りがあります。 実験の目的上、全部溶かしたいと思っています。 過去トピックなどを参考にして、 ・アセトンを風乾させすぎない ・冷エタノール、冷水で洗ってみる ・pHを7.0以上にする ・界面活性剤を変えてみる(Tween20,TritonX100,NP-40は試しました) ・SDSの濃度を濃くする ・TCAを入れてみる をやったのですが、どれもうまく行きませんでした。 なにか他に方法をご存知でしたら、ご教授お願い致します。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---