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ELISA 蛍光法Blankについて・SPSSでのグラフ作成について トピック削除
No.1383-TOPIC - 2011/12/28 (水) 10:13:12 - 初心者
いつもお世話になっております。

前回・前々回の投稿でいろいろと教えていただいたことを元に、
企業のテクニックにも連絡を取って、再度実験を行いました。
その結果、逆シグモイドになっているグラフを得ることが出来ました。
本当に良かったです。
皆様のおかげです、ありがとうございました。

しかし、データは出たものの、まだ何点か疑問があります。

１：企業のテクニックによると、Blankには何も入れないとのことでした。
（washのみ他のwell同様行い、測定時Blankは空の状態）
この方法に少し不安がありましたので、HRPと基質溶液を加えたBlankも同時に作成し、それぞれのBlankを使用した場合のデータを作成したのですが、
HRP等を加えたBlankの値が、10000pg/mlの値よりも高くなってしまい、
最終データがマイナスになる部分が出来てしまいました。
そのため担当のDr.とのディスカッションでは、何も入れないBlankを用いることになりました。
どの位置で補正するかというのは重要なことだと思うのですが、これで本当に大丈夫なのでしょうか。
また、HRP等を加えて値が高くなるのは、手技的な問題なのでしょうか。

ごちゃごちゃ屁理屈を述べるより、実際に検討してみた方が良いと思うのですが、
Kitの残量が少なくあまり回数をこなせないため
出来る限り不安要素を無くしてから実験に望みたいと思っています。
よろしくお願いいたします。


２：SPSSを用いてグラフの作成を試みています。
散布図は描けるのですが、近似線が引けておりません。
SPSSのヘルプや、インターネットのサイト等で検索してみているのですが、
使い方がイマイチよくわかりません。
どなたかご存知の方がいらっしゃいましたら、教えていただけないでしょうか。

以上2点です。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1383-3 - 2011/12/28 (水) 12:27:57 - 初心者
~さん

投稿ありがとうございます。


今回の実験は、以下の手順で行いました。
1：standard・sample等をwellに入れ、antibodyを加ええた後4℃でO/N。
2：翌日、Biotinylated Peptideを加えて23℃（室温）で回転攪拌しながら1.5ｈインキュベート。
3：Bufferで洗浄×4（8連ピペットで入れ、勢いよくひっくり返してBufferを捨て、吸水紙に叩きつけて水分を除く）
4：HRPを加え23℃（室温）で回転攪拌しながら1.0ｈインキュベート。
5：Bufferで洗浄×4（8連ピペットで入れ、勢いよくひっくり返してBufferを捨て、吸水紙に叩きつけて水分を除く）
6：基質を加え23℃（室温）で回転攪拌しながら15minインキュベート。
7：StopSolutionを加え、20min以内（今回は約10分後）に蛍光を測定。

プレートリーダーの設定は以下の通りです。
Mode：Fluorescence Top Reading　　　　　　
Excitation Wavelength：325nm
Emission Wavelength：420nm　　　　　　
Excitation Bandwidth：9nm
Emission Bandwidth：20nm
Gain：99(Optimal）
Number of Reads：25
Integration Time：20μs
Lag Time：0μs
Settle Time：0ms

上記の方法で、Blankは2通り（washのみ・HRP+基質）で行いました。

プレートのブロッキングなどに関してはまだ調べていませんでした。
すぐに確認してみます。

(無題) 削除/引用
No.1383-2 - 2011/12/28 (水) 11:56:05 - ~
>HRPと基質溶液を加えたBlank
>HRP等を加えたBlankの値が、10000pg/mlの値よりも高く
どのような入れ方、洗い方をしているのでしょうか？
また、その製品のプレートはどのようにブロッキング等されているのでしょうか。

HRPが入ったままだったり、プレートに直接固相化されれば、
アフィニティーで結合した分しかウェル内にHRPが無い10,000pg/mLのウェルよりも値が高くなってもおかしくないと思いますが。

ELISA 蛍光法Blankについて・SPSSでのグラフ作成について 削除/引用
No.1383-1 - 2011/12/28 (水) 10:13:12 - 初心者
いつもお世話になっております。

前回・前々回の投稿でいろいろと教えていただいたことを元に、
企業のテクニックにも連絡を取って、再度実験を行いました。
その結果、逆シグモイドになっているグラフを得ることが出来ました。
本当に良かったです。
皆様のおかげです、ありがとうございました。

しかし、データは出たものの、まだ何点か疑問があります。

１：企業のテクニックによると、Blankには何も入れないとのことでした。
（washのみ他のwell同様行い、測定時Blankは空の状態）
この方法に少し不安がありましたので、HRPと基質溶液を加えたBlankも同時に作成し、それぞれのBlankを使用した場合のデータを作成したのですが、
HRP等を加えたBlankの値が、10000pg/mlの値よりも高くなってしまい、
最終データがマイナスになる部分が出来てしまいました。
そのため担当のDr.とのディスカッションでは、何も入れないBlankを用いることになりました。
どの位置で補正するかというのは重要なことだと思うのですが、これで本当に大丈夫なのでしょうか。
また、HRP等を加えて値が高くなるのは、手技的な問題なのでしょうか。

ごちゃごちゃ屁理屈を述べるより、実際に検討してみた方が良いと思うのですが、
Kitの残量が少なくあまり回数をこなせないため
出来る限り不安要素を無くしてから実験に望みたいと思っています。
よろしくお願いいたします。


２：SPSSを用いてグラフの作成を試みています。
散布図は描けるのですが、近似線が引けておりません。
SPSSのヘルプや、インターネットのサイト等で検索してみているのですが、
使い方がイマイチよくわかりません。
どなたかご存知の方がいらっしゃいましたら、教えていただけないでしょうか。

以上2点です。
よろしくお願いいたします。
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