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結果 削除/引用 No.1382-20 - 2012/01/24 (火) 06:20:13 - アマント 皆さま、いろいろな回答をありがとうございました。 最終的に、以下の方法で十分に精製することができました。 最初に「Amicon Ultra-2ml membrane 100kDa」を使って、溶液を100uLまで濃縮、その後「illustra MicroSpin S-400 HR Columns」を2回通す操作をしました。

(無題) 削除/引用 No.1382-19 - 2012/01/16 (月) 11:10:15 - アマント > Sephacrylのカタログはここに > http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0069.asp ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1382-18 - 2012/01/16 (月) 09:34:45 - AP Sephacrylのカタログはここに http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0069.asp

(無題) 削除/引用 No.1382-17 - 2012/01/16 (月) 05:34:37 - アマント APさま、いろいろとアドバイスをありがとうございました。 自作カラム、魅力的ですね。試してみたいと思うのですが、S-400のレジンの単体というのをGEのホームページで探そうとしたのですが、「S-400 resin」と検索しただけではヒットせず、どういう名前で探したらよいものか分かりません。適当な検索語を教えていただけないでしょうか？ ところで、自作のカラムの前に、アドバイスを読んでいて思いついた手法を試そうと思っています。ご指摘の通り、処理したい溶液の体積がカラムよりも多いので、最初に「Amicon Ultra-2ml membrane 100kDa」を使って、溶液をカラムに１度でアプライできる容量まで濃縮しておいて、それをカラムに通す予定です。 前回の実験では、33bpの２本鎖DNAを十分に除去できていなかったので、カラムに通す操作を２−３回繰り返してみます。 結果がでましたら報告したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1382-16 - 2012/01/14 (土) 14:54:16 - AP microspinだとbed volumeが小さく、したがってアプライできるvolumeは小さく（確か50 uLくらいまででしたよね）、void volumeも小さいので、分離を良くするためにも、本実験での体積（600 uL）をいっぺんで処理するためにも、もっとカラム体積を大きくするべきだと思います。 S-400のレジンを単体で買って、バイオラッドで売られているような、empty columnやシリンジを利用した自作カラムなどに詰めて、数mLくらいのbed volumeのカラムをつくるといいと思います。おそらくvoid volがサンプル体積とちょうど等しくなるくらいのbed volが、いちばん効率がいいんだと思いますすが。 単体でそのような製品は売っていないと思いますが、例えば昔あったcDNA library作製kit（かつてAmershamやFarmaciaから出ていた）には、アダプター除去のためにそういうカラムが同梱されていました。スピンカラムの場合も自然落下の場合もありましたので、スピンカラム（スイングロータで）も可能だと思いますが、遠心では分画の可動が変わる可能性があるので、自然落下のほうが無難かもしれません。キットにあった自然落下方式では、例えば0.5 mLバッファーを加えたらカラムからぽたぽた落ちる流出液を0.5 mLエッペンチューブに受けるということを繰り返して、頭から数フラクションまでとって、目的のサンプルが入っているものをプールするというようなやり方でした。短フラグメントが分離しきれていないときは、もう一度、カラムにかけるというのも普通です。

比較結果 削除/引用 No.1382-15 - 2012/01/14 (土) 06:47:00 - アマント 以下の２製品を比較してみました。 - Amicon Ultra-2, Ultracel-0.5 Membrane, 30 kDa - illustra MicroSpin S-400 HR Columns 検査方法は、Ligation産物をPCRして、そのバンドの濃さを比較しました。 もし、２本鎖の33bpのDNAが残っていると、Ligationが阻害されてバンドが薄くなるので、どちらの製品がより除去率が高いかを比較できます。 結果は、Membraneの方は、ほとんど効果が見られませんでした。遠心した際に、Membraneが詰まってしまうのか、ある容量以下にはいくら遠心しても減らないのも気になりました。 Columnの方は、多少は効果があったものの、定量していませんが、50%ぐらいしか除去されていないように見えます。 次回は、Columnを複数回繰り返して実行してみる予定です。 ゲル濾過の方がよさそうだということが分かったので、遠心して使うタイプの、他のゲル濾過の製品が無いか探してみたのですが、条件に合うものが見つかりませんでした。何か、他の製品の情報がありましたら、教えていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1382-14 - 2012/01/05 (木) 04:11:19 - アマント > > ・QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN) > > ・Agencourt AMPure XP (BECKMAN COULTER) > は、溶媒にエタノールを用いますが、架橋たんぱく質というのは > アルコールで変性したりしても差し支えがない実験なんでしょうか。 ご指摘の疑問は尤もで、自分で知っておかなければならないことなのですが、調査不足で明確に答えることができません。 やりたいのは、いわゆる3C実験の変形版です。 (3Cとは、あらかじめ、タンパク質およびDNAを架橋させた上で、制限酵素でDNAを切断し、その後、ライゲーションを行うことで、もともとの３次元空間上で近距離にあったDNA同士をライゲーションさせる実験です。ライゲーションさせた後には、PCRや、次世代シークエンサーを用いて、ライゲーションの効率を比較することで、どのDNAペアが、もともとの立体空間上で、より近い位置関係にあったのかを知ることができます。) タンパク質は、DNA同士を離れないように結合してくれてさえいればよいので、例え変性していても実験結果には影響しないと予想していますが、可能ならば変性しない方法を使いたいと思っています。 プレ実験で、試した以下の２製品は、 ・QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN) ・Agencourt AMPure XP (BECKMAN COULTER) ライゲーションをした後の実験操作がすべてうまくいくかどうかの確認実験のために使用しました。プレ実験は、タンパク質が含まれていない精製したプラスミドを用いたために、上記の２製品は問題なく使えると判断しました。（プレ実験では、最終的にアガロースゲルからの切り出し手法で行いました。しかし、本番のサンプルにはタンパク質が含まれているため、あくまでプレ実験限定の手法ですが・・・） 当初、本番の実験では「Agencourt AMPure XP」を使おうと考えていたのですが、２本鎖の33bpのDNAの除去率が予想していたほど良くなかったという点と、ご指摘のように、タンパク質が含まれているサンプルには使えないのではないかという２点から、代替手法を検討していたのですが、良い手法が見つからずに行き詰っていたため、このフォーラムで質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1382-13 - 2012/01/04 (水) 23:54:34 - ○○ 話がそれますが、質問者がトライしたという > ・QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN) > ・Agencourt AMPure XP (BECKMAN COULTER) は、溶媒にエタノールを用いますが、架橋たんぱく質というのは アルコールで変性したりしても差し支えがない実験なんでしょうか。 うまくいかなかったということなので、どうでもいいところではありますが 少し気になったので・・

(無題) 削除/引用 No.1382-12 - 2011/12/30 (金) 03:39:59 - アマント アドバイスありがとうございます。 ご指摘のとおり、同僚にはフラクションを取る必要があると言われ、その操作についていろいろ説明を受けたのですが、どうも違うようですね。「size-exclusionである」という文章の意味ですが、単に遠心もしくは重力で落とすだけで、落ちてきたものは精製されたものになっているという理解でいいでしょうか。 サンプルボリュームは600uLで、２本鎖33bpのDNA除去後は、10mLのスケールに希釈して次の反応を行う予定です。この場合、遠心か重力を利用したカラムでも大丈夫だということですね・・・。 アドバイスを読んでいるうちに、ゲルろ過の方に心が動いてきたので、Milliporeのホームページで、他の製品も探してみたのですが、先に紹介されたS-400以外で適当な製品が見つからなかったので、この製品と、限外濾過膜の２製品を比較して、決めようかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1382-11 - 2011/12/29 (木) 10:23:43 - AP もう指摘されていますが、ベッドボリューム数mL位で処理できるサンプル液量だったらゲルろ過にペリスタポンプは必要なく、スピンカラムや自然落下で十分です（というか、それくらいのスケールでペリスタを使うことはまずない）。 >(2)条件検討にかなりの時間がかかると予測される。 どのような条件検討を想定しているんでしょうね？フラクションを取るんじゃなくてsize-exclusionであるというところは理解されているのでしょうか。 放射性標識のプローブやcDNAをモニタリングしながら精製した経験からすると、収量もそんなに悪くないはずですよ。 限外濾過膜も選択肢の一つですが、吸着ロス、デッドボリュームによるロス、目詰まりによる流速の低下、期待する精製度に達するまでのバッファー交換の面倒さ（原理的に濾過後も少量の不純物が残るので、バッファーを加えて繰り返して希釈するのみ）というところが、好みや合目的性の分かれるところだと思います。 特にタンパク質を含むサンプルなので、遠心限外濾過を行うならサンプルリザーバーの底に膜が付いていて、遠心方向と液流方向が同方向になるタイプではなく、濾液が横向きとか求心方向に流れるタイプがいいと思います。吸着ロスや目詰まりが、幾分かでも抑えられます。

(無題) 削除/引用 No.1382-10 - 2011/12/29 (木) 07:40:05 - アマント ポンプがなくてもできるカラムがあるんですね。収量よりも、可能な限り２本鎖33bpのDNAの除去を優先したいので、S-400が適していると思いました。 いろいろ考えてみたのですが、今のところ、以下の３製品を使って、比較してみようと考えています。 1) Vivacon 2 30,000 (or 50,000) MWCO, Hydrosart Membrane 2) Amicon Ultra-2, Ultracel-100 Membrane, 100 kDa 3) illustra MicroSpin™ S-400 HR Columns 結果が出ましたら、また報告させていただこうと思っています。 何度もアドバイスをいただき、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1382-9 - 2011/12/29 (木) 06:44:53 - ab 限外濾過だと、目的分子の分子量がMWCOより結構大きければロスが少なくてよいですが、近いとロスが大きいし、バッファー交換に使えると言っても完全に除去するには、何度もバッファー交換が必要になってしまいます。 ゲルろ過だと、煩雑物が排除限界より十分に小さければほぼ完全に除去できますが排除限界に近いと素通りする可能性もあるし、目的分子の分子量が排除限界に近ければゲルの中に入ってしまう確率が高くなり、分画は難しくなります。また、結構ロスします（~80% recovery)。 一長一短なのですが、収量と精製度のどちらを重視するかではないでしょうか。 個人的には、不要産物の除去が目的であればゲルろ過を選びます。 試料の量にもよりますが、少量であればポンプがなくてもできるスピンカラムがあります（GEだとMicroSpin S-300/S-400)。 S-300だと排除限界が120 bp程度、S-400だと270 bp程度です。 メーカーによると、24 base以上の長さのプライマーを使う場合はS-400を推奨して、産物が200 bp以下であればS-300を推奨しています。 目的の分離が結構際どい大きさに見えるので、S-300とS-400のどちらがよいかはやってみないとわからないですね。

(無題) 削除/引用 No.1382-8 - 2011/12/29 (木) 05:51:34 - アマント APさま、詳しい説明をしていただきありがとうございました。とても良くわかりました。 昔所属していたラボで、タンパク質の精製の経験があるという同僚に、Sephacryl S-300について相談してみました。ただ、(1)ラボにポンプが無い。(2)条件検討にかなりの時間がかかると予測される。という２点から、他の方法を検討すべきというのが、彼の結論でした。 せっかく推奨していただいたのですが、新しい機器を購入しなくて済むような方法で何か試せないか、もう少し探してみようと思います。 ホームページで検索しているうちに、Vivacon 2というメンブレンが目的に合っているように思えたので、現在、これについて考慮しているところです。 もし、他に、お勧めのメンブレンや、２本鎖の33bpのDNAの除去手法をご存知の方がおられましたら、教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1382-7 - 2011/12/28 (水) 15:59:56 - AP >一つ質問があるのですが、ゲル濾過では、タンパク質は除去されずに残るのでしょうか？ ゲルクロマトグラフィーは最も基本的な精製法の一つで、タンパク質であろうと核酸であろうと多糖であろうと、分子量の違いで分画する方法です。 ゲルマトリックスの性質によって、分画できる（分子量と移動速度に相関のある）分子量範囲があります。フラクションコレクターなどを使って、分子量ごとの分画をとることができる範囲がそれです。 その分子量の上限を超えた分子は分子量に関係なくvoid volume（ゲルベッド体積のうちゲルマトリックの体積を除いた、バッファーが占める体積）に相当する流出体積で一斉に流出します（いわゆるスッポ抜け）。これを利用すれば、ある分子量以下の分子をカットして、それ以上の分子量の分子を精製するということができます。これがゲルろ過です。 先にあげたS-300は、排除限界が100 bp前後だったはずですので、それより分子量の小さな33 bp DNAはカットされ、300 bpあるいは300 bpにタンパク質が架橋されたものは分子量が大きいので、濾液として回収されるはずです。 キット化、マニュアル化されたアフィニティー精製とか、差次的吸着性とかの精製法にスポイルされているのだか、基本を知らなかったり忘れてしまったりするのは嘆かわしい状況ではなからうか。

(無題) 削除/引用 No.1382-6 - 2011/12/28 (水) 11:23:02 - アマント 皆様、回答をいただきありがとうございます。 > アガロースゲルでエレクトロエリューション。 最も確実な手法だとは思うのですが、溶液中にタンパク質が含まれているので、普通のアガロースでは、うまく泳動できなかったのですが、タンパク質でも大丈夫なアガロースゲルというのは、ありませんか？ > そのサンプルはどのようにして得ているのでしょうか？ > 33merのdsDNAがPCRのミスアニーリングなどで無く、あえて入れているのであれば、 > 事前にビオチン化しておいて、アビジンビーズで除くことが出来ると思いますが。 実は、33merのdsDNAにはビオチンがついています。しかし、その直前の反応で、タンパク質とDNAの混合溶液に、大過剰の33merのdsDNAを加えた後、長鎖DNAにビオチン化したdsDNAを結合させてしまっているので、長鎖DNAと33merのdsDNAの両方がビオチン化してしまっているため、残念ながら教えていただいた手法は使えなさそうです。 > 基本ですが、ゲル濾過 (gel filtertation, size-exclusion choromatography)すればいいんじゃないですか。Sephadex G-50あたりのスピンカラムでいけると思います。 > 分画範囲表を見なおしてみたら、G-50だと排除限界が20 bpでしたので不適でした。Sephacryl S-300あたりでどうでしょう。 アドバイスありがとうございます。ゲル濾過について、まったく知りませんでした。さっそく、これから調べて、注文したいと思います。 一つ質問があるのですが、ゲル濾過では、タンパク質は除去されずに残るのでしょうか？ ゲル濾過を試した後、また、このフォーラムで結果を報告させていただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1382-5 - 2011/12/28 (水) 10:59:45 - AP 基本ですが、ゲル濾過 (gel filtration, size-exclusion chromatography)すればいいんじゃないですか。Sephadex G-50あたりのスピンカラムでいけると思います。 ↑ 分画範囲表を見なおしてみたら、G-50だと排除限界が20 bpでしたので不適でした。Sephacryl S-300あたりでどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1382-3 - 2011/12/28 (水) 08:58:26 - ~ そのサンプルはどのようにして得ているのでしょうか？ 33merのdsDNAがPCRのミスアニーリングなどで無く、あえて入れているのであれば、 事前にビオチン化しておいて、アビジンビーズで除くことが出来ると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1382-2 - 2011/12/28 (水) 08:18:21 - エレクトロ アガロースゲルでエレクトロエリューション。

タンパク質＋DNAの混合物から短いdsDNAだけを取り除くには？ 削除/引用 No.1382-1 - 2011/12/28 (水) 01:08:58 - アマント 以下のものが混ざっている混合溶液があります。 ・タンパク質と架橋したDNA(300bp以上) ・DNA同士で架橋したDNA(300bp以上) ・アニールさせて２本鎖にした33bpのDNA この混合溶液から、２本鎖の33bpのDNAを、可能な限り完璧に取り除く必要があります。次の実験操作では、「タンパク質と架橋した状態のDNA」も必要なために、タンパク質をあらかじめ精製して取り除いておくことはできません。 まずは、プレ実験として、精製したプラスミドDNAと２本鎖の33bpのDNAを、1:100のモル比で混合した溶液を作成し、以下の２製品で２本鎖の33bpのDNAの除去を試みたのですが、十分に精製することができませんでした。 ・QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN) ・Agencourt AMPure XP (BECKMAN COULTER) 何か、よい精製手法や、製品を紹介していただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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