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Boyden chamber アッセイについて トピック削除
No.1358-TOPIC - 2011/12/21 (水) 02:50:57 - aki
Boyden chamberを用いたNHDFの細胞遊走実験を行っており、遊走活性物質としてフィブロネクチンを使用しています。
皆さんに相談したいのは、フィブロネクチンの濃度に関係なく、またネガティブコントロール(DMEM(FBS 0％))でも、全ての試料に対して同程度の細胞が遊走し、活性測定が行えないことについてです。

また、背景として1年前までは遊走数に差がきちんと出て実験はスムーズに進んでいたのですが、細胞実験室の移動があってからこのように実験が上手くいかなくなったことがあります。

これまで、この問題に対して試したことは順番に、
(1)細胞のコンタミを考えましたが、確認されませんでした。
(2)チャンバー、gasketの洗浄(Boyden chamber assay の指示に従いました)
(3)培地(DMEM)にエンドトキシンが混入していることを考え、エンドトキシンフリーの培地を購入し新しく細胞を起こしてみましたが、遊走実験は上記と同じで上手くいきませんでした。

今回 boyden chamber assay に関する情報が少なく、自分の知識ではこれ以上原因追究を行えないと思い、この場を借りて相談させていただきました。

何か原因や、プロトコルに関する質問など、どんな些細な事でも構いませんのでコメントをよろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1358-5 - 2011/12/23 (金) 08:14:46 - ab
追加ですみません。
boyden chamberのポアサイズが違うことはないですよね。

(無題) 削除/引用
No.1358-4 - 2011/12/23 (金) 08:05:43 - ab
> 今日、注意深く細胞を確認したところ、細胞が重なって増殖している部分がみられました。
Foreskin fibroblastやmouse embryonic fibroblastを培養した際に、細胞密度が高い状態でしばらく培養すると、重層した細胞が出てくる事がありました。
形質転換してしまったと思って、そのような細胞が出たら新しく起こし直していたのですが、それほど頻度は高くないです。ただ、株化していない正常細胞は特に形質が変わりやすい印象はあります。

以前と異なる点（細胞のロット、培地・血清のロット、fibronectinのロット）などないでしょうか。

正直なところfibronectinで遊走活性が出るとは知らなかったのですが、調べてみるといくつか論文があるのですね。3T3などの株化細胞を使ってみるとか、chamber内の培地（細胞側）にfibronectinを入れてみて遊走が抑制されるかを確認するとか、細胞の問題か系自体の問題か明らかになれば解決が早いと思います。

(無題) 削除/引用
No.1358-3 - 2011/12/22 (木) 14:46:26 - aki
>abさん

コメントありがとうございます！

恐らく前者のような問題が起こって失敗しているのだとおもいます。
今日、注意深く細胞を確認したところ、細胞が重なって増殖している部分がみられました。癌細胞ならまだしも、NHDFに対してもこのようなことはあり得るのでしょうか？(現在p4のものを起こしてp9です。継代後3日目になります)
何分知識が浅いもので、コメントに対して質問を返す形になってすみません。


一応後者もフィブロネクチンはフィルターを用いて滅菌後、冷凍保存しているので大丈夫だと思っていたのですが、もしかしたら問題があるかもしれません。


自分でも何が問題かわからない状態でコメントを頂けたことで、原因追究の視野が広がりました。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用
No.1358-2 - 2011/12/22 (木) 08:43:13 - ab
差がでないというのが、ネガティブコントロールで遊走が顕著に起こっているのか、それとも刺激による遊走能が低下しているかによって原因が違う気がします。

前者の場合、最初に疑われるのは継代の繰り返しによる形質転換ですが、増殖性・形態などに変化はないでしょうか。
また新しく細胞を購入、あるいは上手くできていたストック（あれば）からでもだめなのでしょうか。

後者の場合、フィブロネクチン自体（保存状態など）に問題はないでしょうか。

刺激時は無血清ですが、接着させるときは血清を使用していると思います。
血清のロットが異なることで、含まれている接着分子（フィブロネクチンなど）の量が異なる事は考えられませんか。

憶測ばかりですみません。

Boyden chamber アッセイについて 削除/引用
No.1358-1 - 2011/12/21 (水) 02:50:57 - aki
Boyden chamberを用いたNHDFの細胞遊走実験を行っており、遊走活性物質としてフィブロネクチンを使用しています。
皆さんに相談したいのは、フィブロネクチンの濃度に関係なく、またネガティブコントロール(DMEM(FBS 0％))でも、全ての試料に対して同程度の細胞が遊走し、活性測定が行えないことについてです。

また、背景として1年前までは遊走数に差がきちんと出て実験はスムーズに進んでいたのですが、細胞実験室の移動があってからこのように実験が上手くいかなくなったことがあります。

これまで、この問題に対して試したことは順番に、
(1)細胞のコンタミを考えましたが、確認されませんでした。
(2)チャンバー、gasketの洗浄(Boyden chamber assay の指示に従いました)
(3)培地(DMEM)にエンドトキシンが混入していることを考え、エンドトキシンフリーの培地を購入し新しく細胞を起こしてみましたが、遊走実験は上記と同じで上手くいきませんでした。

今回 boyden chamber assay に関する情報が少なく、自分の知識ではこれ以上原因追究を行えないと思い、この場を借りて相談させていただきました。

何か原因や、プロトコルに関する質問など、どんな些細な事でも構いませんのでコメントをよろしくお願いします。
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