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(無題) 削除/引用 No.1348-4 - 2011/12/21 (水) 11:57:16 - techas >Harmonia様 Jflyのご紹介、ありがとうございました。 今回投稿した内容以外にも、たくさんの有用な情報を得ることができました。 これからも活用させていただきます。 >AP様 たくさんのアドバイス、ありがとうございました。 ご紹介いただいたサイトで探してみたのですが、目的のベクターは見つけられなかったので、複数個をcotransfectionするか、自作で２つプロモーターを入れるかIRESを入れるかを検討したいと思います。 > >S2細胞内で、プラスミドの複製も起こるのですか？ > ないと思います。 やはり、プラスミドの複製は起こらないですよね、失礼しました。 それにしても、ランダムな組み換えで500〜1000コピーがゲノムに入るというのもすごいですよね。 なにか、組み換え効率を上げる工夫がなされているのでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.1348-3 - 2011/12/20 (火) 15:04:26 - AP ポピュラーなのはお書きになったpAc5.1系ですが、複数のタンパク質発現や薬剤選択の仕組みを備えたようなものは、 ttps://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/store/vectors.html ttp://flybase.org/static_pages/lists/vectors.html このあたりを探して見つからなければ、availableではないんでしょう。 こんな内容の論文が出てるくらいですので、 ttp://www.nature.com/srep/2011/110831/srep00075/full/srep00075.html T2Aペプチドを挟んでpoly cistronicにする方式ですね。publishされたものなので著者にリクエストすれば譲ってもらえると思いますよ。 S2でIRESを使っている例もあります。pAc5.1系でもインサートを組み込むときに二番目のプロモータあるいはIRESなど入れれば、二つのタンパク質をひとつのコンストラクトから発現するということはできますね。 >S2細胞内で、プラスミドの複製も起こるのですか？ ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1348-2 - 2011/12/19 (月) 22:20:08 - Harmonia Jfly に関連する話題はないでしょうか？ http://jfly.iam.u-tokyo.ac.jp/html/discussion/index2.htm

S2細胞で使える発現ベクターを探しています 削除/引用 No.1348-1 - 2011/12/19 (月) 11:51:03 - techas S2細胞の発現系を初めて使ってみることになったのですが、分からないことだらけなので、アドバイスいただけたらと思い投稿いたしました。 どうぞよろしくお願いいたします。 実は、S2細胞で2種類の遺伝子を同時に発現させたいと思っています。 2つのプロモーターが入った発現ベクター（発現を誘導するタイプ）をご存知ありませんか？ 初めてということもあり、invitrogenより発売されているDrosophila Expression Systemというキットの購入を検討しているのですが、このキットに含まれるベクターは、プロモーターが1つのものしかありません。 このキットのマニュアルによると、S2細胞で目的遺伝子を発現している安定株を得るためには、発現ベクターと選択ベクターをcotransfectionする（これらのベクターの比を変えることで、目的遺伝子の発現量を調節できる）と書いてあるので、3つのプラスミドをcotransfectionすることも可能なのかと思うのですが、最終的にゲノムに組み込まれるコピー数を同じにするには、1つのプラスミドにした方が良い気がしています。 また、安定株には500〜1000コピーがゲノムに組み込まれるというようなことが書いてあり、結構多いんだなぁと思ったのですが、これは、トランスフェクションにより取り込んだプラスミドを細胞内でも複製できるということなのでしょうか（ベクターマップを見ると、複製起点としてはpUC oriしかないようなのですが…）？ また、発現ベクターと選択ベクターに分かれているのは、これらの比により発現量を調節するとあることから、同じベクターに目的遺伝子と選択マーカーがのっていると、目的遺伝子の発現量が少なくなってしまうのでわざわざ2つに分かれていると理解したのですが、S2細胞では、発現ベクターと選択ベクターを分けてcotransfectionすることが一般的なのでしょうか？ 教えて頂きたいことをまとめると、 �@2つのプロモーターを持った発現ベクターはありますか？ �AS2細胞内で、プラスミドの複製も起こるのですか？ �BS2細胞の系では、発現ベクターと選択ベクターに分けてcotransfectionするのが一般的ですか？ 基本的なことばかりで恐縮ですが、よろしくお願いいたします。

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