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(無題) 削除/引用 No.1345-9 - 2011/12/19 (月) 13:01:55 - AP 8%なり20%なりの濃いPFA水溶液と10xかなんかのPBSを混ぜて、最終的に4% PFA in PBSにするという操作でしょうか。よく理解できなかったのですが、 >最終的にPH7.4に持っていきます。　バッファーがベースの溶液ではないので、しばしばPHが行き過ぎてしまいます。１０NのHCLでPH8.8（未調整でのPH)が一気に６．０まで低下し、NaOHで７．４までもどしました。 これは、「バッファーがベースの溶液ではないので、」ということはPFA水溶液を作るときの話ですか？　「最終的に」といっているからPBSと混ぜてから話ですか？ いずれにせよ、PFAの水溶液のpHが高すぎるのではないですか。NaOHを入れて溶解しているんだと思いますが、その段階でpHが極端に高くならないようにします。加熱と合わせるとpH 8を超えるほど大量のNaOHはいらないはずです。それをPBSで希釈すれば、PBSのpHからそれほどずれることはないはずです。 pHすることによる塩濃度の変化が影響するかしないか、凍結保存したPFAが良くないかどうか、それはあなたのやる観察の精度や注目する対象次第ですし、その限りで影響や問題が認められないなら、実はなんらかの影響があったとしても、気にしても仕方がないと思います。 ちなみに、PFA固定はPBSよりphosphate bufferの方がよいとする流儀もあって、塩濃度の違いはあまり重要ではないようです。特に細胞の固定ではCarnoyとかメタノール、アセトンなんかも使われるくらいですから、浸透圧やら脱水作用やらがあっても、morphologyは保持されるんじゃないでしょうかね（抗原性とか、オルガネラの形態とかは別として）。

1つのトピック中で名前を変えるのはお勧めしません 削除/引用 No.1345-8 - 2011/12/19 (月) 11:47:21 - ~ >４％PFA in PBSの浸透圧を計算する方法にたどり着きませんでした。 ファントホッフの式で概算くらいは出来るのでは。

固定の奥深さ 削除/引用 No.1345-7 - 2011/12/19 (月) 11:28:03 - お粗末君 PBSにするのは生じたギ酸を中和するためと考えられています。 しかし、長期保存しない理由としては、固定力が変わると形態保持や抗原性の保持の条件が多少かわるためです。毎回同じプロトコールで行っていれば結果は安定するので良いのかもしれません。しかし、弱っている細胞を緩やかに固定すると死に始めて形態が変化します。抗体のエピトープによってはPFA固定が好ましくはないが、生理活性を止める程度に固定をしないと変化をするため、しょうがなく固定をする場合もあります。固定液の濃度や止め方で結果が変化します。４％が全てではありません。目的の分子によってはテクニックを要します。

(無題) 削除/引用 No.1345-6 - 2011/12/19 (月) 11:11:20 - う 浸透圧、浸透圧とおっしゃいますが、よく考えて下さい。 質問者様は、細胞を固定するということですよね。 浸透圧でどうこうなるスピードと 固定されるスピード 固定前と固定後の、細胞の見た目 これらをどう考えるか、どう見るかではないでしょうか？ 理屈をこねて、計算とかどうとか、言葉は悪いですが 笑っちゃいます。 ＞PBSが生理的浸透圧であるわけですから、PFAの部分はどのくらいかはわかりませんが上積みになると思います。 ですよ。 ＞果たしてそれがどのくらいなのか、またこのような固定液の場合、浸透圧はいったいどのくらいの範囲が許されるものなのでしょうか？ 質問者様もおっしゃっているように、見た目でしか判断できないのでは？ そこで、もう一度、 固定される早さと、仮に浸透圧で細胞が破裂するとしてその早さ 一体どんな関係性にあるのでしょうか？ 私は、見た目細胞形態が変化していないと、実際に顕微鏡で「目を凝らして」 見た結果、自分なりに納得していますので、これ以上はどうしようもないです。 計算がどうこうとか、餅を絵に書いてもしょうがないと思います。 ＞４％PFA、鮮度っていったいどのくらい重要なのでしょうか？ これを実験に携わる者だったら断言できないので、皆 「用事調整した方が良い（余計なことを考えたくてすむから）」と 言っているのです。 経験上、ある方法でやっていて、問題が無いということであれば それはそれでいい方法なのだと思います。 あとは、自分がどう思うのか、だと。

PFA 削除/引用 No.1345-5 - 2011/12/19 (月) 10:49:17 - cloning 皆様コメントありがとうございます。NaやClの量による浸透圧の変化に関しては、PFAのように固定を目的としている場合でも影響が出る可能性があるのですね。ということは４％PFAはある程度生理的な浸透圧に近いと仮定してよろしいものなのでしょうか？４％PFAは固定を念頭においていたので、浸透圧に関しては考えても見ませんでした。いろいろ浸透圧の計算方法を見てみたのですが４％PFA in PBSの浸透圧を計算する方法にたどり着きませんでした。PBSが生理的浸透圧であるわけですから、PFAの部分はどのくらいかはわかりませんが上積みになると思います。果たしてそれがどのくらいなのか、またこのような固定液の場合、浸透圧はいったいどのくらいの範囲が許されるものなのでしょうか？もちろん細胞の形態を変えてしまわない範囲ならOkということになると思いますが。固定後はPBSであらうので、余計な塩は洗い落とされるでしょうから、以後のステップではNaやClは無視できると思いますので、あくまでも固定中に関する質問です。

(無題) 削除/引用 No.1345-4 - 2011/12/18 (日) 17:28:14 - ABZO いまは4% PFA/PBS(中性緩衝ホルマリン溶液）売ってるよ。安いよ。

(無題) 削除/引用 No.1345-3 - 2011/12/18 (日) 02:53:21 - R >使わなくてすむはずであったNaやClは溶液の性質を変えてしまうほどのインパクトがあるものなのでしょうか？ 加えた溶液の濃度と量でどれだけ浸透圧が変化するか計算してみましょう。 >４％PFA、鮮度っていったいどのくらい重要なのでしょうか？ ホルムアルデヒドはカニッツァーロ反応により徐々にギ酸とメタノールを生じます。遅い反応なので数日は大丈夫だと思いますが、長期保存は避けるべきでしょう。どれくらいが長期かは難しいところですが。

(無題) 削除/引用 No.1345-2 - 2011/12/16 (金) 13:46:20 - TS ＞PHが逆サイドにふれたときに本来使わなくてすむはずであったNaやClは溶液の性質を変えてしまうほどのインパクトがあるものなのでしょうか？ よく考えればご理解できると思うのですが、入れてしまった量によるでしょう。少量であれば、NaやClが数μM〜mM増えるだけでしょうから影響ありません。浸透圧が大きく変わるほど入れてしまった場合は、影響ありますよね。 ＞４％PFA、鮮度っていったいどのくらい重要なのでしょうか？ 保存中に、たしかギ酸か何かが出来てしまうんでしたか。正確な返答ではありませんで、他の人のコメントを待ちたいですが、わたしは、４度で数日くらいは使いますが、人によっては１ヶ月くらいは問題なかった、と言っていました。

4% PFA 削除/引用 No.1345-1 - 2011/12/16 (金) 12:31:27 - PFA 非常に基本的な質問で申し訳ありません。４％PFA in PBS solutionを作る過程で、最終的にPH7.4に持っていきます。　バッファーがベースの溶液ではないので、しばしばPHが行き過ぎてしまいます。１０NのHCLでPH8.8（未調整でのPH)が一気に６．０まで低下し、NaOHで７．４までもどしました。１NのHCLを使えばすむ話なのですが、PHが逆サイドにふれたときに本来使わなくてすむはずであったNaやClは溶液の性質を変えてしまうほどのインパクトがあるものなのでしょうか？いままでずっと疑問に思っていながら、恥ずかしくて聞けなかった質問です。 後追加ですが、私のラボでは４％PFAをマイナス20度で長期に保存し、必要におうじて溶解して使っています。しかし多くのほかのラボのメンバーは毎回フレッシュに作ったほうがよいとアドバイスしてくれます。４％PFAの使用目的は培養細胞をガラススライドにまいて、固定後IFのためです。４％PFA、鮮度っていったいどのくらい重要なのでしょうか？

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