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(無題) 削除/引用 No.1336-4 - 2011/12/14 (水) 21:27:20 - U TK-1さん どうも有難うございます。 （１）AID-Creは良さそうですね。In vivo解析を始める際には考慮したいと思います。 （２）Creによるgenome damageについては、下記の論文で報告されており、Creの活性レベルに依存した染色体障害によるようです。特にCreERで誘導した場合は活性がrobustで、titrationが必要なようなのですが、いい条件が見つかりません。ひょっとするとloxPのrecombinationを起こすレベルでは毒性が避けられない可能性もあり、経験のある方の情報が伺えると有り難いと思っております。Deleter Creなど、constitutiveにCreを発現するマウスでは、マウス開発の段階で、致死的ゲノム障害を起こさないレベルでCreを発現するラインが選択されたものと考えられますが、CreERなどinducibleのマウスでは、Cre onlyでもinduceすれば毒性が出ると思います。 Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Loonstra A, Vooijs M, Beverloo HB, Allak BA, van Drunen E, Kanaar R, Berns A, Jonkers J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 31;98(16):9209-14. Direct hematological toxicity and illegitimate chromosomal recombination caused by the systemic activation of CreERT2. Higashi AY, Ikawa T, Muramatsu M, Economides AN, Niwa A, Okuda T, Murphy AJ, Rojas J, Heike T, Nakahata T, Kawamoto H, Kita T, Yanagita M. J Immunol. 2009 May 1;182(9):5633-40. MPさん コメント有難うございます。「閾値」そのものは存在すると思いますが、それがloxPのrecombinationを起こすレベルより高いところにあるのかどうかが、問題です（TK-1さんから御指摘頂いている点です）。ConstitutiveのCreマウスでは、表現形として確認できるレベルでのgenome damageは見られない場合が多い事を考えると、loxPのrecombinationを誘導しつつ、genome damageを最小限に抑える条件があるはずとは思っているのですが、今のところうまく行ってません。

(無題) 削除/引用 No.1336-3 - 2011/12/14 (水) 13:08:48 - MP Creの毒性は出るものには出ます（毒性がでてくる閾値が存在？）。とあるLck-Creのlineでは胸腺内分化が明らかに異常になっていた、という経験があります。

(無題) 削除/引用 No.1336-2 - 2011/12/14 (水) 07:01:26 - TK-1 AID-creなんかいかがですか？ > （２）では、高濃度4OHTでCreによる毒性（genome damageと考えております）。 ここでどういう根拠で結論づけられているのかよくわかりません。Creによる毒性と考えられているのですから、Cre-onlyのネズミでも”毒性”が見られるということでしょうか？CreERにしろ、stage-specific なtransgeneにしろ、組み替えがおこるレベルのCreが発現したときに毒性が出るとおっしゃるのであれば、実験は成り立たないと思いますが。

マウス成熟B細胞のconditional knock-in 削除/引用 No.1336-1 - 2011/12/14 (水) 05:12:22 - U マウス成熟B細胞（memory B cell）での、Cre recombinaseによるconditional knock-inを検討しております。残念ながら、Mx1-CreやCD19-Creでは、導入された変異が未熟B細胞の段階で著明なtoxicityを示し、うまく行きません。今のところfundが取れていないため、あらたなCreマウスを購入する余裕がなく、取りあえず、手持ちのreagentを用いてin vitroの実験をセットアップしているところです。 これまでに試したのは、（１）Adenoviral Cre (type 5, CMV promoter)で脾臓細胞にMOI=10から100で感染、（２）CreERTマウスと掛け合わせ、4OHT（10-1000nM, over night）で脾臓細胞をin vitroで処理、の２通りの方法ですが、（１）ではCreによるrecombinationはほとんど見られず、（２）では、高濃度4OHTでCreによる毒性（genome damageと考えております）、低濃度では（１）と同様recombinationがほとんど誘導されない、という問題に直面しております。 どなたか、マウス脾臓B細胞に、in vitroでAdenoviral Creを感染させた経験のある方、あるいはCreERでのrecombinationをin vitroで誘導した経験のある方がいらっしゃったら、プロトコールなど教示頂けませんでしょうか。 また、最終的にはin vivoでの解析を考えており、成熟B細胞でのみCreを発現するマウスについても、情報をお持ちの方がいらしたら、教えてもらえませんでしょうか。私の知る範囲では、Cgamma1-Creくらいしか思い当たらず、このマウスについても使用経験がないため、どの程度有効なのか、使い勝手がどうなのか、まったくイメージできません。 よろしくお願い申し上げます。

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