いつもお世話になっております。
H2DCFDAで細胞内に発生した活性酸素を定量する際に二重染色でヘキストで染色していますが、最近蛍光が以前より弱いようです。
試薬の劣化を考え、試薬は調整し直しました。顕微鏡のランプは交換したばかりなのでランプのせいではないようです。光軸調整もしてあります。
染色手順は細胞をPBSで二回リンス後、血清を含まない培地5mlに10mM H2DCFDA 5ul, 1mMヘキスト 1ulを加えたものに置換し、37度で1時間インキュベーションしてます。
インキュベーション後、PBSで二回リンスし、培地ではなくPBS存在下で顕微鏡観察しています。
特にやり方を以前と変えてないのですが、以前の再現が出来ません。
何か考えられる原因がありましたらご教授下さい。
ちなみに細胞のコンディションで染色の具合いが変わることはありますか?
使っている細胞はマクロファージ細胞のJ774A.1細胞です。
宜しくお願いします。 |
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