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(無題) 削除/引用 No.1319-10 - 2011/12/12 (月) 08:47:42 - Harmonia 私は、WBで定量することには言及していません。最初に無視しろといわれていましたので。 Re: No.1319-6 1.0が何であるかを熟慮し、また、誤差が生じる要因を熟慮した後に、定量する、あるいは、定量せずにすべてのサンプルが同じメンブレンに乗る工夫をして、「見た目違うでしょ？」と、訴える。 ＞ 回収率に関して私の理解では同等と期待される バンドの濃さに及ぼすぶれの原因すべてを積算して１割より小さいと言い切れるのなら、それでいいです（１割とは、あなたの例の２回目の差）。 羅列すると、 １．ディッシュに播き込んだ細胞数 ２．ディッシュに生えていた細胞数 ３．ディッシュから回収された細胞の総数 ４．サンプル溶液に溶け込むことができた（残渣とならなかった）細胞数 ５．ウェルに載せたサンプルの液量（ぴペッティング誤差） ６．ゲルで目的位置まで移動した目的タンパク量 ７．メンブレンに転写された目的タンパク量 ８．目的タンパクに張り付いた１次抗体と２次抗体の量 ９．メンブレンで光っていたシグナル 通常、３を推量して「同細胞数あたりのシグナル強度」とするのでしょうから、（感覚的に誤差が小さいとみなすことができる値もありますが)そのシグナルを出すに至った４から８の誤差は、分かりませんよね。 １を前提にする方も居ますが、１から３を推測するのは飛躍しすぎですね。 「ある計測値1.0が何であるか」を考案するなり、過去の例を真似ることは大切です。 統計処理で何を使うかは、別の話しとして。

(無題) 削除/引用 No.1319-9 - 2011/12/11 (日) 11:28:50 - qq おそらく統計学者は、5個や10個のサンプル数（sample sizeと呼ばないと怒られるかも）で、母集団の平均値が異なるかどうかを議論するとは、思っていないということです。 つまり、等分散であろうと異分散でどちらであろうと関係ないということです。 でも、pairedかunpairedかは、実験系の解釈の違いなので、まあ、見過ごせないということです。 WTを100にするところで、適切なコントロール（GAPDHやACTBなど）がWTでもTgでも100のままで変わらないデータがあれば、少し気持ちが傾くかもしれません。 それでも細胞株やマウス個体のgeneticやepigeneticなバックグラウンドの差でないことを明かにするためには、Tgの遺伝子をノックダウンするとか、変異Tgで変わらないとかの傍証が必要でしょう。 結局、総合判断で結果がでてくるのだと思います。 サンプルサイズが５や１０のt検定でカツカツのデータなんかそれだけで信じるのは、自己責任だということでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1319-7 - 2011/12/11 (日) 08:30:26 - 100 > amiさん > qqさん 有難うございます。 お二人のお考えは大まか似ているようですね。 その上でお二人に（もちろんこのトピックをご覧になっている他の方にも）質問があります。 1. 実際にWBの定量を行った論文で、下の（常に100）とするグラフを見かけます。当然対照群の分散、error barは0です。この時、私の知らない何らかの、しかし許される「トリック」を使っているのでしょうか？またこの場合の結果に対する印象は「あ〜やっちゃてるよ...」という感じでしょうか？ 2. 今後、WT、Tg細胞に薬剤（A,B,C.D...）と処理していく予定です。そうすると全部を一枚のゲルでは流しきれません。1回目、２回目、、と違うゲルでWBを行う必要性が出てきます。その場合には、下の（常に100）とする方法、または常に参照となるサンプルを端に流してその値で補正する、二つの方法が考えられます。どちらの方法を取りますか？または他の方法？？ 3. お二人とも今回の例では上の値を用いてStudentのt-testを行っているようですが、何故Studentなのでしょうか？私の場合は統計の知識が乏しく、正直、生物系の論文の似たような実験で良く使われているから、といった理由です。 しかしながら同僚の根拠となる、また過去にこのフォーラムでも出てきた下記の主張 http://aoki2.si.gunma-u.ac.jp/lecture/BF/index.html を踏まえるとWelchに傾きつつあります。御意見お聞かせ下さい。 宜しくお願い致します。

実験の流れ 削除/引用 No.1319-6 - 2011/12/11 (日) 07:56:57 - 100 > Harmoniaさん 有難うございます。 やはりWBの定量性に関する問題点を無視するというのは乱暴だったかも知れません。 ただ御回答を正直あまり理解できずにいます。 > たとえば回収。各回内のWTとTgの回収率は同じでしょうか？ 示した値はただの例ですがarbitary unitとお考え下さい。全体の流れを少し詳細に説明致しますと、基本的に細胞はPBSで回収し、pptとして冷凍保存、実験1-5が出揃った後に一斉に可溶化、タンパク質定量、同一のゲルでSDS-PAGE、同一のメンブレンに転写、抗体反応、ECL、フィルムに焼き付け。バンドの定量は過去のトピックで問題視されていますが、ECLを用いたWBのバンドをスキャナーで取り込みImageJでバンドインテンシティーを測った値だとお考え下さい。 ですので回収率に関して私の理解では同等と期待される、と考えております。但し、タンパク質の定量を行ったとしても扱っているタンパク質（だったりリン酸化抗体だったり）の問題で、GAPDHのようなローディングコントロールと比較して実験間（1-5）でどうしても差が出てきてしまいます。それが補正（対照群を常に100とする）を考えている理由でもあります。 つまりHarmoniaさんの「リンゴの重さ」の例とは大きく異なります。ですので仮にそれぞれを別のゲルでSDS-PAGE~検出したものでは各実験間の値を直接比較はできません。 同様の実験をする時（検定部分は抜きにして）Harmoniaさんはどのようにサンプルを準備なさいますか？？

(無題) 削除/引用 No.1319-5 - 2011/12/10 (土) 20:15:42 - ami たぶん、どの検定が正しいか自分でわかるには、ここで私がいくら説明するより、自分で勉強するのが正しいですが、自分で勉強して答えに到達するのがベストですが、今答えが必要、ということなので言うと、最初のStudent's t-testがたぶん１番正しいです。paired test、WTを100にしたテストは明らかな間違いです。

(無題) 削除/引用 No.1319-4 - 2011/12/10 (土) 18:42:56 - qq まず、統計は気にはなるけど、専門家ではないのでそのつもりで、 この場合、培養細胞株でpaired-tを行うのは、サンプルがpairedになっていないのでダメじゃないかな。pairedは、経時変化やそれに近いものだけではないでしょうか？ そんな風に考えると、WTを100としてTgを比で表すのも、トリッキーというか、違うんじゃない？、と言った感じがします。 ま、気にしちゃうと何にも出来なくなりそうだけど、どうなんでしょうかねえ。 最初に示したStudent-t (p=0.174)の結果が公正な結果だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1319-3 - 2011/12/10 (土) 14:44:29 - Harmonia ＞ 5回独立してこの2種類の細胞を培養、回収し、同一のゲルで流した時 ということなので、「同一のゲルで見る」に関しては、組で議論できますが、「培養」と「回収」を組にする意味はどうですか？ということです。 たとえば回収。各回内のWTとTgの回収率は同じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1319-2 - 2011/12/10 (土) 14:35:57 - Harmonia 二つのことを考えなきゃいけないです。 １．定量方法が妥当か。 ２．検定方法が妥当か。 ２は詳しい方に譲るとして、１の課題。 WT の100, 90, 80, 120, 105 って、何が1のときの値でしょうか？また、単位は何でしょうか？ たとえばこの５個の数字が、りんごをハカリで測ったときの値で、単位がグラムだとしたら、かなり誤差が小さいと仮定しても問題ないと、日常的な経験から考えることができます。また、測定値を「何グラム」という絶対値とみなしても、さほど問題は無いと思います（実際は、グラム原器なりキログラム原器との相対値ですが)。 一方、WB で測ったと仰る個の値たちは、どうでしょうか？ この５個の数字の振れが何に由来するのか、WGとTgの数字の組で議論されていますが、この５組は組み合わせに意味があるのか。あると思われているから組み合わせているはずですが、それならその意味とは？

対照群を常に100とした時の統計処理 削除/引用 No.1319-1 - 2011/12/10 (土) 06:20:12 - 100 WTまたはTg由来の培養細胞における各種タンパク質の発現をWBで検出、比較しております。 例えば、5回独立してこの2種類の細胞を培養、回収し、同一のゲルで流した時、 それぞれデンシトを元に得られた値が WT Tg 1 100 120 2 90 99 3 80 92 4 120 150 5 105 126 だったとします。 これらをpaired t-test, Student's t-test, Welch's t-testを用いp値をだすと それぞれ0.007, 0.174, 0.180となります。 もともとみたいタンパク質のWT-Tg間の差は（あると期待されるが）小さく、 1-5回の実験間の差（WT1-5またはTg1-5）は（無いと期待されるが）有る程度予想されていたので 1回目、2回目、、、5回目それぞれのWTを値を100とした時のTgの比の値を示しました。 WT Tg 1 100 120 2 100 110 3 100 115 4 100 125 5 100 120 またこれらをpaired t-test, Student's t-test, Welch's t-testを用いp値をだすと それぞれ0.002, 0.0001, 0.002となります。 質問はこのケースでは実際どの検定方法を使うのが確からしいのか？と言う点です。 以前、似た様な実験で同齢のWT、KOマウス（n=5 each）を同時に準備し、 臓器を取り出し同一のゲルでSDS-PAGEし最終的にWBで定量を行った際は比を取る事無く（上の例）、Student's t-testで検定を行っておりました。 ただ最近同僚とWBの定量に関して話をした時に彼は、Welch's t-testが頑健？だから 二群間の比較ならばF検定なしで大概何も考えずにこれを用いていると言ってました。 また下の例ではWTをすべて100にしてしまっているので分散は0になってしまっています。 これで等分散、不等分散を問うのは意味があるのでしょうか？ サンプルサイズはこれ以上増やせないと仮定して下さい。 WBの定量性に関する問題点もここでは無視して下さい。 統計に関する知識が足りない事は承知しておりますが、アドバイス頂けると幸いです。 また同様のトピックが既にあるようでしたら教えて下さると有難いです。

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