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IwObDoRxMzWkyf 削除/引用 No.1317-14 - 2012/06/13 (水) 02:12:42 - lcjthc d5UU0e <a href="http://tvldjmvowcge.com/">tvldjmvowcge</a>

FzrwTuvYqHKEpd 削除/引用 No.1317-13 - 2012/06/10 (日) 20:31:11 - tpumwlxpx 3ZCcq0 <a href="http://gwthallckrei.com/">gwthallckrei</a>

wGRwBhfnRzMob 削除/引用 No.1317-12 - 2012/06/10 (日) 04:19:34 - Gisele Wait, I cannot fathom it being so striatghfroward.

付着単層培養細胞の染色方法について 削除/引用 No.1317-11 - 2012/03/24 (土) 14:13:31 - いの いつもお世話になってます。 　今度、細胞株のEGFRの染色を行う予定ですが、付着細胞の染色は初めてで方法がよくわかりません。chamberを使用します。固定後に、凍結させて融解させるみたいなことが書いてあるのですが、この操作の意味等もわからないんです。 　どなたか、方法を詳しく教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1317-10 - 2012/01/16 (月) 16:40:04 - ＊ >このO/Nは何時間を指すのでしょうか。 だいぶ昔に調べたときも16時間とあった気がします（ソースも覚えてませんが）。 そのとき聞いた説の中には「欧米の研究者は9時−5時で働くからだ」なんてのもありましたよ。

(無題) 削除/引用 No.1317-9 - 2011/12/23 (金) 18:04:23 - ABZO 一般的にはPFA固定は長過ぎないこと、必要最小限にしておくことといわれている。過度の固定は抗原性の低下、消失につながることがあるので。組織の場合は組織塊内部に浸透していくまでの時間を考慮して数時間震盪ないし4C一晩くらいやるけど、細胞ならせいぜい数分〜15分くらいとおもう。ただこれはあくまで一般論（経験的にそのくらいで上手く行くケースがわりと多いということ）。抗原によってはもちろん例外もあるとおもう。想像するに論文の人たちはたぶん普通の方法でいまいちだったので、条件振ってそのくらいがいい感じのデータになったんだとおもう。どうしてそれがよいのか？は理由があるのだとおもう。でも限られた時間の中で、その追求をすることが他の大事な事に優先されるほどの事かかどうかは分からない。

(無題) 削除/引用 No.1317-8 - 2011/12/20 (火) 13:12:28 - う この手に質問に思うことですが、 私たちは、理論実験をしているのではありません。 なので、何か問題があったら、実際の実験で各々の研究者が試すという 実際の実験がもっとも単純かつ確実なものだと思います。 また、生物の研究者はそれほど実験作業の理論について 詳しくないと、私は思います。 それで、それほど意味が分かっていなくても 試したこと、経験したことで行動が決まってくるということです。 例えば、 具体的な例として、ここでのPFAの固定時間ですが、 目的のシグナルが出なかったから、 「固定時間長めにした方が、より固定されて検出できるかも」 くらいの動機で試したのでないかと、私は想像します。 問題は、そういうことを試したということが重要で、 理論であーだこーだ言ってもあまり意味が無い、 やったら出たのだもの、ということです。 あとは、自分の実験系で あるタンパク質を免疫染色で検出したい ↓ まず、テクニックとして少なくとも他のタンパク質は検出できるという前提を設定（ポジコン） ↓ そのポジコンがでる条件で、目的タンパク質を検出してみる ↓ 出ない場合、 抗体をバックグラウンド覚悟で濃い濃度にする 固定時間、固定液の種類、濃度を試す 固定後処理をいろいろ試す 論文を参考に抗体を変える 出ている人に頼る 本当にその組織細胞に出ているのか他の実験で試す ここに理論は参考程度、PFAが大体どのくらいの時間で浸透するのかぐらいしか あーだこーだ言う必要は無いと思います。 ＞また、時間を短縮した際、固定できているか確かめる指標はあるのでしょうか。 だから、ポジコンでしょ？ 上記のような書き込みから、このような書き込みをしてしまいました。 乱文にて失礼します。

(無題) 削除/引用 No.1317-7 - 2011/12/20 (火) 12:47:58 - う ポジコンとネガコンは何のためにあるのでしょうか？

重ねて質問です。 削除/引用 No.1317-6 - 2011/12/20 (火) 09:44:09 - むむ TOPICさん、失礼致します。 同様の質問なので、ご一緒させてください。 通常は4%PFAで４℃O/Nが多く見受けられます。 このO/Nは何時間を指すのでしょうか。 免染以外ののプロトコルでO/Nは16時間ぐらいと把握して行なっています。 できれば免染でもう少し時間を短縮したいのですが、 みなさまはどの程度をO/Nとしているのでしょうか。 また、時間を短縮した際、固定できているか確かめる指標はあるのでしょうか。 みなさまの経験をお聞かせいただけると幸いです。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1317-5 - 2011/12/11 (日) 12:45:22 - です TS様 ご回答ありがとうございます。 やはり長時間での固定はあまり推奨されるものではないのでしょうか。 特定のタンパクの固定には、長いほうが良いのかもとも思ったのですが。 み様 ご回答ありがとうございます。 エピトープは細胞内に多く存在すると考えております。 一部は分泌後細胞膜にくっついているのかも知れませんが･･･。 引き続き、長時間での固定についてご意見をお伺いしたいです。

(無題) 削除/引用 No.1317-3 - 2011/12/10 (土) 16:03:44 - み 膜透過の点は、細胞外の糖蛋白がエピトープという理由ではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1317-2 - 2011/12/09 (金) 20:23:12 - TS PFAは、室温では１時間に１ｍｍくらいの組織を浸透・固定できると聞いたことがあります（情報源は知りませんが）。おっしゃるとおり、不必要に長い固定は、抗原性を低下させるだけだと思います。 培養細胞とは、単層接着細胞、浮遊細胞のどちらかということですね。そうすると。 >１　そもそも，固定を長時間かけて行うことのねらいとは何なのでしょうか 当日に処理するのが面倒くさかった。 >２　PFA処理時間　RT 数分と、4℃ overnightでは、細胞の固定で何か違いがあるのでしょうか 4℃ overnightでは、抗原性が低下するものが出てくるかも。 組織の場合だと、4℃ overnightは一般的だと思いますが。

ＰＦＡ処理時間について 削除/引用 No.1317-1 - 2011/12/09 (金) 20:05:16 - です いつもお世話になっています。最近免疫染色を始めた初心者です。 培養細胞におけるPFAの処理時間について質問です。 私は細胞中の、ある糖たんぱく質の染色を行っております。 これまで、methanol，PFA(後triton)での固定を試みましたがなかなかうまく染まりません。 そこで再度論文を探してみると、同種の細胞、同じ目的たんぱく質の染色において、4%PFA 4℃ overnight(triton等の膜透過処理なし)でのprotcolが紹介されていました。 組織ならともかく、培養細胞でPFAを長時間処理するのは浅学ながら知りませんでした。なんとなくですが、長時間過ぎて流出したり抗原性に影響を与えたりするのではとも思います。また、膜透過されていない点も気になりました。 そこで皆様に質問です． １　そもそも，固定を長時間かけて行うことのねらいとは何なのでしょうか ２　PFA処理時間　RT 数分と、4℃ overnightでは、細胞の固定で何か違いがあるのでしょうか 少しでも何か情報をお持ちの方がいましたら、ご回答のほど宜しくお願い致します。

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